先天性上斜肌麻痹性斜視患兒眼外肌NGF、GAP-43表達變化及意義

劉素江，韓惠芳，王世煥，王娟，代書英，劉雅麗，杜哲，韓愛軍

(河北省眼科醫院，河北邢臺054000)

先天性麻痹性斜視是由于眼外肌肌肉、神經核、神經麻痹所致的眼外肌器質性病變，表現為單條或多條眼外肌的部分或完全麻痹[1]。根據先天性上斜肌麻痹性斜視的病變肌肉部位，可分為上斜肌麻痹性斜視及下斜肌亢進性斜視，其中上斜肌在該病中起到麻痹作用，而下斜肌在該病中起到亢進作用。通常表現為患眼向外上方斜視，若雙眼發病時則為交替性外上斜。目前對于先天性上斜肌麻痹性斜視的發病機制尚不明確。近年研究證實，先天性上斜肌麻痹性斜視的發生與眼外肌本體感受器信號傳輸失調有關，神經營養因子在神經調節及信號傳輸過程中具有重要作用[2]。神經生長因子(NGF)及生長相關蛋白(GAP-43)是目前研究較多的兩類神經營養因子，對促進神經再生長及調控神經功能具有重要作用[3]。2013年1月～2014年12月，我們檢測了28例先天性上斜肌麻痹性斜視患兒上下斜肌組織中NGF及GAP-43的表達，探討NGF及GAP-43在先天性上斜肌麻痹性斜視發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取同期在我院行斜視矯正手術治療的先天性上斜肌麻痹性斜視患兒28例，男 16例、女12例，年齡3～12(6.32±2.12)歲，臨床表現為患眼向外上方斜視、代償頭位、面部發育不對稱。根據病變部位分為上斜肌(斜視上斜肌組)15例、下斜肌(斜視下斜肌組)13例。納入標準：無明顯屈光不正；經戴棱鏡矯正治療1年以上視力無明顯改善；為上斜肌或下斜肌單條肌肉病變。排除標準：有外傷史、既往手術史、合并嚴重心肝腎功能不全、合并惡性腫瘤、因其他眼外肌所致的斜視。另選取同期無眼部疾病、因眼外傷導致眼球破裂行眼球摘取手術的患兒30例，男16例、女14例，年齡3～12(6.47±2.12)歲，術中取正常上斜肌(正常上斜肌組)、正常下斜肌(正常下斜肌組)組織各15例。兩組性別、年齡差異無統計學意義。患兒家屬均簽署知情同意書，愿意參與本研究。

1.2 上下斜肌組織病理改變觀察 采用HE染色法。將各組上下斜肌組織置入2.5%戊二醇中，制備HE染色標本，光鏡下觀察各組上下斜肌組織病理改變。

1.3 上下斜肌組織NGF及GAP-43蛋白表達檢測 采用免疫組化染色法。取各組上下斜肌組織制備石蠟切片，經微波加熱、抗原修復后，加入一抗試劑二氨基聯苯胺(美國Dako公司)，4 ℃孵育24 h。分別加入二抗試劑NGF及GAP-43單克隆抗體(美國Sigma公司)，室溫孵育1 h。DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片。采用PH7.4濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液作為陰性對照。采用電子顯微鏡觀察標本情況，由兩名病理師分別進行閱片，結果一致時作為確診結果。染色深度評分：不顯色或顯色模糊為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；褐黃色為3分。染色面積：0%～5%為0分，>5%～35%為1分，>35%～65%為2分，>65%為3分。將染色深度評分與染色面積評分相加后取平均值，作為蛋白表達強度，得分0.5～1為1分，1.5～2.0為2分，2.5～3.0為3分，以得分≥2分計為陽性表達。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件。組間計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組上下斜肌組織病理改變 光鏡下可見，正常上、下斜肌組細胞核數量正常、肌細胞體積無明顯改變、肌纖維排列錯落有致、肌小節結構清晰、線粒體無變性、肌細胞肌節正常、肌原纖維排列一致。斜視上斜肌組細胞核數量減少、肌細胞萎縮、肌纖維排列紊亂及水腫、肌小節結構模糊、線粒體空泡樣變性、肌細胞肌節紊亂、肌原纖維排列彎曲。斜視下斜肌組肌細胞內纖維彎曲排列，肌節紊亂，肌節線模糊，線肌消失，肌細胞內線粒體增生并伴有不同程度空泡樣變肌水腫，細胞器數目增加，間質增寬。

2.2 各組NGF蛋白表達比較 正常上斜肌組、斜視上斜肌組NGF蛋白陽性表達率為分別為80.0%(12/15)、46.7%(7/15)，正常下斜肌組、斜視下斜肌組NGF蛋白陽性表達率分別為73.3%(11/15)、84.6%(11/13)。斜視上斜肌組NGF蛋白陽性表達率低于正常上斜肌組，斜視下斜肌組NGF蛋白陽性表達率高于正常下斜肌組(P均<0.05)。

2.3 各組GAP-43蛋白表達比較 正常上斜肌組、斜視上斜肌組GAP-43蛋白陽性表達率分別為73.3%(11/15)、33.3%(5/15)，正常下斜肌組、斜視下斜肌組GAP-43蛋白陽性表達率分別為60.0%(9/15)、84.6%(11/13)。斜視上斜肌組GAP-43蛋白陽性表達率低于正常上斜肌組，斜視下斜肌組GAP-43蛋白陽性表達率高于正常下斜肌組(P均<0.05)。

3 討論

眼外肌屬于橫紋肌，是由許多肌纖維組成的，每條肌纖維包含了許多肌管系統及肌原纖維。肌原纖維由粗細肌絲組成，整齊排列，具有橫紋外觀[4]。先天性上斜肌麻痹性斜視由于配偶肌及拮抗肌功能過強，導致拮抗肌功能減弱，使拮抗肌形態發生變化。近年研究發現，先天性上斜肌麻痹性斜視在雙眼視覺反射建立前已經發生斜視度較小、眼外肌功能不足、視功能發育異常的情況[5]。國外研究指出，肌纖維橫截面與患者年齡、病程無相關性，而與下斜肌亢進程度有密切關系[6]。李麗等[7]研究發現，具有單個運動終板的纖維肌可通過增加肌纖維橫截面積從而引起肌細胞肥大，并表現為肌纖維長度及運動終板肌纖維增加。

先天性上斜肌麻痹性斜視根據病變部位可分為上斜肌麻痹性斜視及下斜肌亢進性斜視。上斜肌麻痹后會導致其配偶肌及拮抗肌功能過強，而間接拮抗肌功能減弱，主要表現為肌組織輕度變性，肌小節結構異常，肌細胞內線粒體堆積并形成空泡。下斜肌主要功能為收縮時產生外旋作用力，當其麻痹發生病變后，下斜肌麻痹會導致肌細胞內纖維彎曲排列，肌節紊亂，肌節線模糊，線肌消失，肌細胞內線粒體增生，并伴有不同程度空泡樣變肌水腫，細胞器數目增加，間質增寬。本研究發現，斜視上斜肌組細胞核數量減少、肌細胞萎縮、肌纖維排列紊亂及水腫、肌小節結構模糊、線粒體空泡樣變性，肌細胞肌節紊亂、肌原纖維排列彎曲，提示病變上斜肌呈退行性病變、萎縮表現；下斜肌組肌細胞內纖維彎曲排列，肌節紊亂，肌節線模糊，線肌消失，肌細胞內線粒體增生并伴有不同程度空泡樣變肌水腫，細胞器數目增加，間質增寬，提示病變下斜肌出現肌肉肥大、功能亢進表現。

Huawei等[8]研究指出，肌細胞與運動神經元間存在依賴于神經沖動的復雜關系，肌細胞正常生理結構的維持需要依靠神經營養因子，當神經營養因子丟失后會導致肌肉生理結構、新陳代謝等方面發生變化。NGF及GAP-43是目前研究較深入的神經營養因子，對外周神經再生及信號傳導具有重要的作用。NGF具有較強的促進感覺纖維再生的功能，而GAP-43可促進運動纖維再生[9]。NGF對運動神經、感覺神經、交感神經具有良好的促進作用，具有促進神經元再生、細胞肥大及神經突起生長的作用[10,11]。Wasternack等[12]研究認為，GAP-43是一種神經源性肌肉營養因子，具有肌肉和神經雙重調節作用，在肌肉退性病變、運動神經元疾病及神經肌肉損傷治療中起到重要作用。本研究結果顯示，斜視上斜肌組NGF及GAP-43蛋白陽性表達率均低于正常上斜肌組，斜視下斜肌組NGF及GAP-43蛋白陽性表達率均高于正常下斜肌組，提示先天性上斜肌麻痹性斜視的發生與麻痹斜肌中NGF及GAP-43表達異常有關，結合病理學觀察結果，考慮先天性上斜肌麻痹性斜視患者的病變上斜肌呈退行性病變、萎縮，可能與NGF及GAP-43活性下降有關，而病變下斜肌出現肌肉肥大、功能亢進表現，可能與NGF及GAP-43活性增加導致肌纖維長度增加有關。

綜上所述，NGF及GAP-43蛋白在先天性上斜肌麻痹性斜視發病中具有重要作用，通過加強或拮抗NGF及GAP-43蛋白的表達對先天性上斜肌麻痹性斜視的治療具有一定指導意義。