腦膠質瘤組織中酪氨酸激酶受體B表達及其與病理分級的關系

楊海峰，黃淑紅

(1北京市仁和醫院，北京102600；2山東大學醫學院)

腦膠質瘤組織中酪氨酸激酶受體B表達及其與病理分級的關系

楊海峰1，黃淑紅2

(1北京市仁和醫院，北京102600；2山東大學醫學院)

目的 觀察腦膠質瘤組織中酪氨酸激酶受體B(TrkB)的表達情況，并探討其與病理分級的關系。方法 將45例份腦膠質瘤患者手術切除腫瘤組織作為觀察組，其中Ⅰ+Ⅱ級18例份(低級別)、Ⅲ+Ⅳ級27例份(高級別)；另取10例份正常腦組織作為對照組，采用實時熒光定量PCR檢測兩組TrkB mRNA表達，免疫組織化學染色、Western blot法檢測兩組TrkB蛋白表達，分析腦膠質瘤TrkB蛋白表達與病理分級的關系。結果 觀察組、對照組腦組織中TrkB mRNA的相對表達量分別為0.188 1±0.030 1、0.083 5±0.037 4，TrkB蛋白的相對表達量分別為0.955 6±0.063 7、0.448 9±0.072 4，兩組相比，P均<0.05。低級別、高級別腦膠質瘤組織中TrkB mRNA的相對表達量分別為0.101 4±0.027 9、0.237 1±0.038 3，TrkB蛋白的相對表達量分別為0.765 3±0.048 1、1.082 5±0.083 5，兩者相比，P均<0.05。結論 腦膠質瘤組織中TrkB表達升高，高病理分級較低病理分級TrkB表達高。

腦膠質瘤；酪氨酸激酶受體B；病理分級

腦膠質瘤是常見的中樞神經系統原發性腫瘤，可在腦實質中浸潤性生長，侵襲性強，手術很難進行完全切除，且其復發率高、治愈率低、預后差。受體酪氨酸激酶B(TrkB)作為一種癌基因，在神經母細胞瘤組織中高表達[1]，并通過與其配體——腦源性神經營養因子(BDNF)結合激活一系列重要的信號轉導通路，進而對腫瘤的發生發展進行調控[2～6]。TrkB作為抗腫瘤治療的新靶點受到越來越多的關

注，但目前有關TrkB在腦膠質瘤中的作用研究較少。本研究觀察了腦膠質瘤組織中TrkB的表達變化，并探討其與腫瘤病理分級的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2013年5月～2015年12月北京市仁和醫院45例份腦膠質瘤患者手術切除腫瘤組織作為觀察組，均經病理檢查確診。腦膠質瘤患者中男31例、女14例，年齡7～75歲、中位年齡41歲，其中>60歲6例、≤60歲39例。以2007年WHO腦腫瘤分類標準進行分期，其中Ⅰ級9例、Ⅱ

級9例、Ⅲ級13例、Ⅳ級14例。以Ⅰ+Ⅱ級為中低度惡性(低級別)，Ⅲ+Ⅳ級為高度惡性(高級別)。另選10例份同期顱腦外傷術中切除的正常腦組織作為對照組。所有病例術前未進行放、化療，均有詳細的臨床資料，本研究方案經醫院倫理委員會批準。

1.2 腦組織TrkB mRNA檢測 將上述兩組部分組織標本用4%中性甲醛進行固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，保存切片；另外部分標本于-80 ℃冰箱保存。取新鮮冰凍腦膠質瘤組織和正常腦組織，提取RNA，通過反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR實驗。TrkB mRNA的上游引物：5′-GTCCAGACACTCAGGATTTG-3′，下游引物:5′-TCCTCCACAGTGAGGTTAG-3′。內參GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。反應體系：模板cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物均為0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環。實驗重復3次。使用2-ΔΔCt分析法分析TrkB mRNA相對于內參GAPDH的相對表達量。

1.3 腦組織TrkB蛋白檢測 ①免疫組織化學染色：對腦膠質瘤及正常腦組織石蠟切片進行免疫組織化學EnVision法染色，具體步驟如下。60 ℃烘烤石蠟切片2 h，切片脫蠟至水；雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中90 ℃微波抗原修復8 min；5%二抗正常血清室溫孵育封閉2 h；兔抗人TrkB抗體(1∶200，美國Abcam公司)室溫孵育1 h后4 ℃過夜；聚合物增強劑室溫孵育20 min，酶標抗鼠聚合物室溫孵育25 min，常規DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照組，同時做空白對照，已知陽性片作為陽性對照，以細胞膜或胞質出現明顯的棕色顆粒為陽性細胞，無著色則為陰性。在光學顯微鏡40×10視野下，每個樣本選取5個視野，采用Barnes法統計陽性細胞數，按棕色顯色細胞的比例進行計分，<1%計0分、1%～<11%計1分、11%～<51%計2分、51%～<80%計3分、≥80%計4分，將1～4分定義為陽性、0分為陰性。②采用Western blot法。取新鮮冰凍腦膠質細胞瘤組織和正常腦組織按照質量體積比1∶3加入組織裂解液進行裂解，BCA法測定總蛋白濃度，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，隨后電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗兔抗人TrkB抗體/鼠抗人β-tubulin抗體(1∶1 000，美國Sigma公司)4 ℃孵育過夜，洗滌后加二抗HRP標記的抗兔IgG抗體(1∶5 000，美國Abcam公司)孵育1 h，洗膜后ECL化學發光法顯色。采用Image J分析所得圖像，以TrkB/β-tubulin灰度比值表示TrkB蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組腦組織TrkB mRNA表達比較 觀察組、對照組腦組織中TrkB mRNA的相對表達量分別為0.188 1±0.030 1、0.083 5±0.037 4，兩組相比，P<0.05。

2.2 兩組腦組織TrkB蛋白表達比較 免疫組化染色結果顯示TrkB蛋白在腦組織胞質中呈棕色顆粒狀。觀察組TrkB蛋白表達1、2、3、4分分別為4、2、12、27例，對照組分別為8、2、0、0例，兩組比較P<0.05。Western blot結果顯示，觀察組、對照組腦組織中TrkB蛋白的相對表達量分別為0.955 6±0.063 7、0.448 9±0.072 4，兩組相比，P<0.05。

2.3 腦膠質瘤TrkB表達與病理分級的關系 低級別、高級別腦膠質瘤組織中TrkB mRNA的相對表達量分別為0.101 4±0.027 9、0.237 1±0.038 3，TrkB蛋白的相對表達量分別為0.765 3±0.048 1、1.082 5±0.083 5，兩者相比，P均<0.05。

3 討論

腦膠質瘤為顱內最常見的腫瘤，發病率高，惡性程度高。雖然近幾年腦膠質瘤的治療技術迅速發展，但目前其臨床治療效果仍不滿意[7]。目前，靶向治療作為一種新興的治療方法逐漸應用于膠質瘤治療。研究[8,9]發現，一些非編碼RNA對靶向治療神經膠質瘤具有良好的治療效果。除此之外，一些在腫瘤發生發展過程中的關鍵基因也是重要的分子靶點，現已證明血管內皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞生長因子是常用的抑制腫瘤血管生長的重要靶點[10]，與VEGF作用的單克隆抗體藥物貝伐珠單抗現已用于復發性膠質母細胞瘤的治療[11,12]。

TrkB是BDNF的高親和力特異性受體，TrkB與BDNF結合后會發生磷酸化而被激活[13]，活化的TrkB可以誘導PI3K的活性，導致Akt的激活，進而通過PI3K/Akt信號通路調控細胞增殖、生長等生理活動[3～5]；TrkB/BDNF還可以激活MAPK和PLC信號轉導途徑，這三條信號轉導途徑密切調控著腫瘤細胞的增殖、浸潤轉移等。越來越多的研究表明，TrkB/BDNF與腫瘤的發生發展進程密切相關，TrkB/BDNF信號途徑的激活會刺激腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉移，促進腫瘤血管的發生，同時還會抑制腫瘤細胞的失巢凋亡[14]。TrkB在多種實體瘤中過表達，如肺癌[6]、鼻咽癌、舌鱗狀細胞癌[15]、食管鱗癌[16]、肝癌[17]、結腸癌[18]、子宮內膜癌[19]等。TrkB在神經母細胞瘤中異常高表達，并能促進神經母細胞瘤的擴散和浸潤能力[20,21]。在鼻咽癌中，高表達的TrkB通過介導腫瘤細胞的失巢凋亡增強腫瘤細胞的化療耐藥性[14,22]。因此，TrkB作為一種原癌基因，在惡性腫瘤生成機制中的作用越來越受到重視，并且研究認為TrkB可以作為抗腫瘤靶向治療的新靶點[14]。本研究觀察了腦膠質瘤組織中TrkB蛋白的表達變化，發現TrkB在腦膠質瘤組織中異常高表達，且在高病理分級的腦膠質瘤組織中表達量明顯高于低病理分級，不管是在mRNA水平還是蛋白水平，這與Xiong等[21]的研究結果一致。除此之外，腦膠質瘤組織中TrkB的異常高表達與患者的年齡、性別無關，但與病理分級有關，且病理分級越高TrkB表達量越高，表明TrkB的異常高表達可能與腦膠質瘤的發生發展密切相關，TrkB可能在腦膠質瘤由低級向高級轉變的過程中發揮重要作用。有研究[23]表明，卵巢上皮癌中TrkB的過表達使PI3K/Akt信號通路過度激活，導致惡性腫瘤的侵襲性及轉移性增強。關于TrkB影響腦膠質瘤發生發展的分子機制還需要進一步的實驗來探索。

綜上可見，腦膠質瘤組織中TrkB表達升高，高病理分級較低病理分級TrkB表達高。抑制TrkB的過表達可能對腦膠質瘤的治療提供幫助。

[1] Brodeur GM, Nakagawara A, Yamashiro DJ, et al. Expression of TrkA, TrkB and TrkC in human neuroblastomas[J]. J Neurooncol, 1997,31(1-2):49-56.

[2] Liu Q, Wong-Riley MT. Postnatal development of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and tyrosine protein kinase B (TrkB) receptor immunoreactivity in multiple brain stem respiratory-related nuclei of the rat[J]. J Comp Neurol, 2013,521(1):109-129.

[3] Qi D, Ouyang C, Wang Y, et al. HO-1 attenuates hippocampal neurons injury via the activation of BDNF-TrkB-PI3K/Akt signaling pathway in stroke[J]. Brain Res, 2014,1577(7):69-76.

[4] Luo L, Liu XL, Li J, et al. Macranthol promotes hippocampal neuronal proliferation in mice via BDNF-TrkB-PI3K/Akt signaling pathway[J]. Eur J Pharmacol, 2015,762(8):357-363.

[5] Xiang J, Pan J, Chen F, et al. L-3-n-butylphthalide improves cognitive impairment of APP/PS1 mice by BDNF/TrkB/PI3K/AKT pathway[J]. Int J Clin Expe Med, 2014,7(7):1706-1713.

[6] Odate S, Nakamura K, Onishi H, et al. TrkB/BDNF signaling pathway is a potential therapeutic target for pulmonary large cell neuroendocrine carcinoma[J]. Lung Cancer, 2013,79(3):205-214.

[7] 陳正和,陳忠平.腦膠質瘤的治療進展[J].新醫學,2015，46(7):417-422.

[8] 郝萱語,李方方,王萍.非編碼RNA靶向治療神經膠質瘤研究進展[J].山東醫藥,2015，55(30):92-94.

[9] An S, Jiang X, Shi J, et al. Single-component self-assembled RNAi nanoparticles functionalized with tumor-targeting iNGR delivering abundant siRNA for efficient glioma therapy[J]. Biomaterials, 2015,53(2):330-340.

[10] Gatson N, Chiocca EA, Kaur B. Anti-angiogenic gene therapy in the treatment of malignant gliomas[J]. Neurosci Lett, 2012,527(2):62-70.

[11] Kaloshi G, Brace G, Rroji A, et al. Bevacizumab alone at 5 mg/kg in an every-3-week schedule for patients with recurrent glioblastomas: a single center experience[J]. Tumori, 2013,99(5):601-603.

[12] 陳寶師,晉強,張忠,等.聯合靶向治療復發惡性腦膠質瘤的研究[J].中華神經醫學雜志,2015,14(7):740-742.

[13] Jia S, Wang W, Hu Z, et al. BDNF mediated TrkB activation contributes to the EMT progression and the poor prognosis in human salivary adenoid cystic carcinoma[J]. Oral Oncol, 2014,51(1):6115-6120.

[14] 莫賽軍,鄭乃剛,曹文波,等.BDNF/TrkB信號途徑與抗腫瘤治療[J].癌變·畸變·突變,2014,26(6):476-478.

[15] 魏秀娟,吳修胤,佟冬冬,等.BDNF/TrkB在舌鱗狀細胞癌中的表達及BDNF對其增殖能力的影響[J].山東大學學報(醫學版),2016,54(6):50-54.

[16] 許躍,李晟磊,范欽和.腦源性神經營養因子與其受體酪氨酸激酶B在食管鱗癌中蛋白表達的相關性及其臨床意義[J].中華實驗外科雜志,2015,32(12):3176-3178.

[17] 張克蘭,王志明,陳能志,等.BDNF,TrkB在原發性肝癌中的表達及BDNF對肝癌細胞株Bel-7402的作用[J].中國普通外科雜志,2010,19(5):516-524.

[18] 鄭偉平,黎敏華,陶萍萍,等.TrkB在子宮內膜癌中的表達及意義[J].實用腫瘤雜志,2014,29(1):41-44.

[19] 劉建英.TrkB-BDNF信號傳導通路對神經母細胞瘤細胞耐藥和轉移的影響[J].中華小兒外科雜志,2013,34(8):607-612.

[20] Croucher JL, Iyer R, Li N, et al. TrkB inhibition by GNF-4256 slows growth and enhances chemotherapeutic efficacy in neuroblastoma xenografts[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2014,75(1):131-141.

[21] Xiong J, Zhou LI, Lim Y, et al. Mature brain-derived neurotrophic factor and its receptor TrkB are upregulated in human glioma tissues[J]. Oncol Lett, 2015,10(1):223-227.

[22] Ng YK, Wong EY, Lau CP, et al. K252a induces anoikis-sensitization with suppression of cellular migration in Epstein-Barr virus (EBV)--associated nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Investl New Drugs, 2012,30(1):48-58.

[23] Yu X, Liu L, Cai B, et al. Suppression of anoikis by the neurotrophic receptor TrkB in human ovarian cancer[J]. Cancer Sci, 2008,99(3):543-552.

(收稿日期：2016-09-06)

國家自然科學基金資助項目(31271519)。

黃淑紅(E-mail： huangshdoctor@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.020

R739.41

B

1002-266X(2017)02-0060-03

2016-09-05)