拉喹莫德灌胃對大鼠腰椎間盤退變的治療作用

王偉，方軍，趙光宗，李華壯

(1濰坊醫學院，山東濰坊 262500；2益都中心醫院)

拉喹莫德灌胃對大鼠腰椎間盤退變的治療作用

王偉1,2，方軍2，趙光宗2，李華壯2

(1濰坊醫學院，山東濰坊 262500；2益都中心醫院)

目的 觀察拉喹莫德灌胃對大鼠腰椎間盤退變的治療作用。方法 將 60只大鼠隨機分為空白對照組(A組)、模型對照組(B組)、拉喹莫德組(C組)各20只。B、C組建立腰椎間盤退變模型，術后2周C組給予拉喹莫德按60 mg/(kg·d)灌胃，A、B組予以等體積的生理鹽水灌胃，連續6周持續給藥。第8周處死各組大鼠，手術取出L4～5節段腰椎間盤中的髓核組織，采用光鏡和電鏡觀察大鼠椎間盤髓核組織病理，采用Western blot法檢測大鼠椎間盤髓核組織中HIF-2α。結果 C組較B組退變壞死細胞數量明顯減少，脊索細胞數目較多僅少量細胞核遭到破壞，膠原纖維和周期性橫紋大部分可見且有序。A、B、C組大鼠椎間盤髓核組織中HIF-2α相對表達量分別為115.6±12.5、150.3±18.2、127.2±18.7，兩兩相比，P均<0.05。結論 拉喹莫德灌胃對大鼠腰椎間盤退變具有治療作用，這可能是通過減少髓核組織中HIF-2α的表達實現的。

腰椎間盤退變；髓核；拉喹莫德；缺氧誘導因子2α;大鼠

目前關于椎間盤退變的確切發病機制尚無定論。研究[1]證明，缺氧可以促進新血管形成并介導炎癥反應。缺氧誘導因子(HIF)自1992年被國外學者[2]發現以來，已被證實與多種惡性腫瘤密切相關[3～6]，先后有同屬的HIF-1α、HIF-2α因子被發現。缺氧依賴性基因表達的調節作用發生在轉錄水平，并由缺氧敏感的轉錄因子，如HIF-2α介導完成。正常的椎間盤為無血供組織，而血管的侵入會導致HIF-2α激活，從而導致基質的降解，引起椎間盤退變[7]。研究證實，HIF-2α的表達在突出椎間盤要明顯高于正常椎間盤，表達程度與細胞凋亡之間存在正相關性，髓核內HIF-2α的表達會伴隨椎間盤髓核組織破壞程度的增加相應升高[8]。拉喹莫德是一種新型的HIF-2α抑制劑，本研究觀察了拉喹莫德灌胃對腰椎間盤退變大鼠椎間盤髓核組織中HIF-2α表達的影響，觀察拉喹莫德灌胃對大鼠腰椎間盤退變的治療作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 3月齡的Wistar大鼠60只，體質量(250±2.6)g，購自山東大學動物中心。SP-9000試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；拉喹莫德購自Biogen Idec公司。

1.2 腰椎間盤退變大鼠模型制備及分組方法 將 60只大鼠隨機分為空白對照組(A組)、模型對照組(B組)、拉喹莫德組(C組)各20只。B、C組通過臨床手術方法建立腰椎間盤退變模型[9]，方法如下：氯胺酮麻醉后手術切除大鼠腰椎兩旁棘突、關節突以及棘上、棘間韌帶等。術后2周，C組按60 mg/(kg·d)給予拉喹莫德灌胃，A、B組予以等體積的生理鹽水灌胃，連續6周持續給藥。第8周處死各組大鼠，手術取出L4～5節段腰椎間盤中的髓核組織，以4%多聚甲醛固定備用。

1.3 大鼠椎間盤髓核組織病理觀察方法 分別采用光鏡和電鏡觀察。將上述三組大鼠部分腰椎間盤中的髓核組織脫水、石蠟包埋、6 μm厚切片，HE染色，于光鏡下觀察腰椎間盤組織的改變。余下部分組織以3%戊二醛固定24 h，PBS漂洗，四氧化鋨固定2 h，脫水10 min，醋酸鈾塊染，脫水，環氧丙烷與環氧樹脂618包埋、切片，檸檬酸酸鉛染色，于電鏡下觀察。

1.4 大鼠椎間盤髓核組織中HIF-2α檢測 采用Western blot法。采用微量天平稱取適當量的髓核組織，向組織中加入1 mL的裂解液，行低溫快速勻漿處理。提取組織總蛋白，按照蛋白定量試劑盒說明書對組織提取液中蛋白濃度進行檢測。每份標本選擇50 μg的總蛋白，經過10%的聚丙烯凝膠給予電泳分離，HIF-2α的分離膠濃度為8%。濕法電轉移至硝酸纖維素膜上，給予封閉處理后，加一抗4 ℃過夜，加二抗持續孵育2 h。DAB顯色處理，并給予內對矯正。以GAPDH作為內參，計算大鼠椎間盤髓核組織中HIF-2α蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 三組大鼠椎間盤髓核組織病理觀察結果 ①光學顯微鏡觀察結果：A組可見類軟骨細胞和脊索細胞在椎間盤中央區髓核組織分布比較均勻，數量多，膠原纖維排列整齊。纖維環排列規則整齊，纖維環與髓核之間的過渡區較寬。B組髓核的類軟骨細胞和脊索細胞數目減少，纖維環見纖維化樣變且排列不規整，甚至斷裂，可見大量成纖維樣細胞及退變壞死細胞，纖維環與髓核之間的過渡區變窄。C組表現為纖維環纖維化樣變,髓核的脊索細胞及軟骨樣細胞數目減少，僅出現少量的成纖維樣細胞及退變壞死細胞。②透射電鏡觀察結果：A組類軟骨細胞豐富，細胞質內含有大量的粗面內質網和小的線粒體，異染色質豐富。脊索細胞細胞形狀不規則，數目較多，核圓，常染色質含量豐富，胞質內可見大量的糖原顆粒、正常的線粒體、粗面內質網等細胞器。膠原原纖維排列規則整齊，方向一致，著色均勻，可見周期性橫紋，內部結構清楚。B組類軟骨細胞數目明顯減少，可見退變或壞死的類軟骨細胞。胞內細胞核變形。胞質中可出現散在的核固縮或核碎裂，胞質模糊不清。脊索細胞數目較少且不規則，核內異染色質數目較A組相比明顯增多，胞質內細胞器數目減少、結構紊亂，可見腫脹、壞死的線粒體及粗面內質網。大量的細胞出現核固縮、核溶解、核碎裂。膠原原纖維排列雜亂，方向不一，膠原橫紋消失，纖維內部可見大量的較高電子密度細顆粒的鈣化點。C組退變或死亡細胞數目較B組明顯減少。脊索細胞形狀多但不規則，細胞周圍有少量的突起且大小不等，并可見其形成的空泡狀結構。核內異染色質增多，胞質內細胞器減少，粗面內質網及線粒體數目減少但結構基本正常，僅少量的細胞出現核固縮、核溶解、核碎裂。膠原原纖維排列基本規則，大小及方向基本一致，周期性橫紋大部分可見，膠原內僅散在存在高電子密度細顆粒的鈣化點。

2.2 三組大鼠椎間盤髓核組織中HIF-2α表達比較 A、B、C組大鼠椎間盤髓核組織中HIF-2α蛋白相對表達量分別為115.6±12.5、150.3±18.2、127.2±18.7，兩兩相比，P均<0.05。

3 討論

椎間盤退變可引起一系列脊柱退變及繼發性病變，在臨床上具有較高的發病率，且治療效果一般。因此，對椎間盤退變的分子生物學機制展開研究具有重要意義。在以往的研究中我們發現，椎間盤組織髓核細胞的主要功能是有效合成并分泌細胞外大分子物質及蛋白聚糖等，此類物質作為椎間盤組織代謝與活動中的重要組成部分，與椎間盤基質的合成、破壞有密切關系。另有研究[10]報道指出，存在于椎間盤組織中的髓核細胞數量減少或活性下降，均可對細胞外基質成分的穩定性造成不同程度破壞，從而形成惡性循環，加重椎間盤退變。HIF-1α是誘導以及維持細胞氧內環境穩定的一類核心因子，在調節細胞凋亡、分化及能量代謝等方面具有重要的意義。HIF-2α與HIF-1α同屬HIF家族。HIF-2α主要作用是使機體細胞適應低氧環境，促進血管生成因子、基質蛋白、炎性因子及調控細胞凋亡、分化基因的表達。HIF-2α與多種腫瘤如肺癌、胃癌、宮頸癌等有關，且被認為是骨關節炎軟骨退變的關鍵調控因子之一[11,12]。HIF-2α作為低氧狀態下關鍵調節物的低氧誘導因子，能激活炎性因子的表達，誘導泡沫細胞的形成，調控細胞的凋亡及分化。髓核是無血管組織，生長在缺氧的環境，髓核內的組織細胞具有類似關節軟骨細胞的組織學和生理結構，且HIF在大鼠髓核中表達已被證實。這為我們研究HIF-2α在退變的椎間盤組織中的表達和機制提供了理論基礎。HIF-2α在細胞低氧環境及代謝過程中的作用至關重要。當椎間盤發生退變時，會出現營養物質供應不足，局部代謝障礙，營造了一種低氧環境。為適應這種缺血缺氧狀態，HIF-2α因子表達增強。HIF-2α主要通過兩個方面參與機體缺氧的調節，一方面處于激活狀態的HIF-2α通過與靶基因位點形成轉錄起始復合物，促進血管生長因子的表達，誘導新血管形成來適應機體的缺氧狀態；另一方面通過直接介導Wnt/β-catenin、核因子κB等的表達以作用于軟骨細胞[13]。至于HIF-2α在退變椎間盤組織的表達是否也是通過上述相同機制有待于我們繼續研究。

拉喹莫德又稱作BG-12，是一種新型的免疫抑制劑，主要用于治療成人復發型多發性硬化癥。拉喹莫德可能的作用機制是通過激活核因子κB通路，特異性結合多種細胞基因的啟動子、增強子位點，調控機體的免疫應答反應，減少炎性因子在中樞系統的表達，使中樞系統避免損傷。但是拉喹莫德對于椎間盤組織是否具有同樣的保護作用尚沒有研究。本研究Western blot檢測結果顯示，A、B、C組椎間盤髓核中HIF-2α均有一定程度的表達，而A組HIF-2α蛋白表達非常少，C組表達次之，B組表達較多。本研究將類軟骨細胞、髓核細胞、膠原纖維作為觀察對象，從細胞的超微結果觀察拉喹莫德對細胞的影響，發現C組較B組退變或死亡細胞數目明顯減少，脊索細胞數目較多僅少量細胞核遭到破壞，膠原纖維和周期性橫紋大部分可見且有序。因此，我們認為拉喹莫德灌胃對大鼠腰椎間盤退變具有治療作用，這可能是通過減少髓核組織中HIF-2α的表達實現的。

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方軍(E-mail： 690574781@qq.com)

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R686

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1002-266X(2017)02-0045-03

2016-09-22)