miR-363、Eomes在人臍帶間充質干細胞誘導神經樣細胞中的表達及意義

趙曉彬,楊子微,高振宇

(1遼寧省消防總隊醫院，沈陽 110032；2錦州市中心醫院)

miR-363、Eomes在人臍帶間充質干細胞誘導神經樣細胞中的表達及意義

趙曉彬1,楊子微2,高振宇2

(1遼寧省消防總隊醫院，沈陽 110032；2錦州市中心醫院)

目的 觀察miR-363、脫中胚蛋白(Eomes)在人臍帶間充質干細胞(HUMSCs)誘導的神經樣細胞中的表達變化，并探討其意義。方法 培養HUMSCs并應用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、視黃酸、丁基羥基茴香醚聯合誘導分化為神經樣細胞，采用免疫熒光化學法檢測誘導前后細胞β-Ⅲ-tubulin和NSE的表達；real-time PCR檢測誘導前后細胞中miR-363和Eomes mRNA的表達，Western blot檢測誘導前后細胞中Eomes蛋白的表達；運用生物信息學方法(TargetScan和miRanda)對miR-363和Eomes基因的靶向配對關系進行預測，采用熒光素酶報告系統進行鑒定。結果 光鏡下可見HUMSCs呈梭形均勻分布，誘導分化后細胞呈圓形、有長的突起；免疫熒光檢測發現誘導14 d的細胞β-Ⅲ-tubulin和NSE表達呈陽性，神經樣細胞誘導成功。HUMSCs誘導分化前后miR-363相對表達量分別為1.00±0.31、0.32±0.02，Eomes mRNA相對表達量分別為1.00±0.22、15.73±0.85，Eomes蛋白相對表達量分別為0.21±0.02、0.78±0.06，兩者比較，P均<0.05。生物信息學軟件結果顯示miR-363和Eomes基因靶向配對良好，熒光素酶報告系統鑒定發現miR-363能夠抑制Eomes mRNA表達。結論 miR-363能夠靶向作用Eomes 3′UTR負性調控HUMSCs神經樣細胞分化后Eomes的表達。

微小RNA-363；脫中胚蛋白；人臍帶間充質干細胞；神經樣細胞

脫中胚蛋白(Eomes)是神經發育中后期表達的重要轉錄因子，在神經祖細胞中高表達[5]，推測其可在神經的誘導分化過程中起重要作用。miRNA是一類小的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)互補，調節靶基因的表達[6]，以此參與個體發育、細胞分化以及疾病發生過程中基因表達的調控。本研究應用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、視黃酸(RA)、丁基羥基茴香醚(BHA)聯合誘導HUMSCs向神經樣細胞分化，觀察細胞分化后miR-363、Eomes表達情況，并探討兩者的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 HUMSCs由錦州市中心醫院保存。反轉錄試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞、RNAiso for small RNA和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司，定點突變試劑盒購自Stratagene公司，pmirGLO質粒和Dual-Luciferase?報告系統購自Promega公司，脂質體2000購自Invitrogen公司，miR-363模擬物購自GenePharma公司，siRNA購自Dharmacon公司，IBMX、RA和BHA購自Sigma公司，兔抗人微管蛋白(β-Ⅲ-tubulin)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗體購自Santa Cruz公司，293T細胞購自上海生物細胞研究所。

1.2 HUMSCs神經樣細胞的誘導分化及鑒定 取HUMSCs接種到25 cm2培養瓶內，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3～4 d換液1次，待細胞達到80%融合后，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化并傳代。HUMSCs傳至3～4代，細胞均勻分布，形態規則均一，呈梭形。取第三代細胞做誘導分化，培養基中加入0.1 mmol/L IBMX、0.5 μmol/L RA和200 μmol/L BHA。HUMSCs誘導分化后可見細胞呈圓形，有長的突起。取誘導培養14 d的細胞，PBS沖洗，10%甲醛固定后，0.1% BSA封閉1 h。分別加兔抗人β-Ⅲ-tubulin抗體(1∶300)以及NSE抗體(1∶200)，4 ℃過夜，PBS浸洗3次，每次5 min。二抗加FITC標記山羊抗兔IgG抗體(1∶500)，DAPI復染細胞核。免疫熒光檢測結果發現，細胞中β-Ⅲ-tubulin和NSE兩種標志物均陽性表達，顯示綠色熒光，神經樣細胞誘導成功。

1.3 細胞中miR-363、Eomes mRNA檢測 采用real-time PCR。取誘導成功的神經樣細胞(誘導組)和HUMSCs(對照組)，分別加入TRIzol或RNAiso for small RNA提取總mRNA或總miRNA，運用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，稀釋后加入SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和引物。序列如下：Eomes正向引物為5′-CAAGGTTCTGTATTTATTT-3′，反向引物為5′-TTTAACTCATCTGATAGC-3′；GAPDH正向引物為5′-CCCCTTCATTGACCTCAACT-3′，反向引物為5′-ATGAGTCCTTCCACGATACC-3′；miR-363正向引物為5′AATTGCACGGTATCCATCTGTA-3′(通用引物試劑盒自帶)；U6正向引物為5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，反向引物為5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應條件為94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40 個循環。采用2-ΔΔCt法對反應結果進行定量分析。

1.4 細胞中Eomes蛋白表達檢測 采用Western blot法。取上述兩組細胞，分別加入RIPA裂解液充分震蕩后，超聲破碎，4 ℃離心20 min，采用BCA法測定樣品總蛋白量。取15 μL樣品SDS-PAGE分離后轉膜，應用4% BSA封閉1 h，加入兔抗人Eomes抗體(1∶200)，4 ℃過夜后，滴加二抗(1∶800)，4 ℃搖床1 h后凝膠成像系統ECL發光顯影。條帶經掃描后用圖像分析系統進行半定量分析，根據積分吸光度值對比分析條帶的強弱，β-actin作為內參，Eomes/β-actin代表Eomes的相對表達量。

1.5 細胞中miR-363與Eomes的關系驗證 運用miRNA生物信息學軟件TargetScan和miRanda對miR-363和Eomes基因(NM_005442)的靶向匹配關系進行預測。取誘導成功的神經樣細胞，運用正向引物5′-CCGAGCTCATTGTCACCAGCATA-3′和反向引物5′-GCTCTAGAAGCCAGCCAGTATTA-3′擴增Eomes mRNA 3′UTR，定點突變試劑盒構建Eomes 3′UTR突變體(3′UTRmu)。Sac Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切Eomes 3′UTR、3′UTRmu以及pmirGLO質粒，構建熒光素酶報告載體(3′UTR-pmirGLO和3′UTRmu-pmirGLO)，轉化入感受態細胞中擴增。脂質體2000轉染Eomes 3′UTR-pmirGLO或3′UTRmu-pmirGLO以及miR-363模擬物或對照miRNA進入293T細胞，將對照miRNA的Eomes 3′UTR-pmirGLO熒光素酶表達量設為1，Dual-Luciferase?報告系統檢測熒光強度。

2 結果

2.1 兩組細胞miR-363、Eomes mRNA表達比較 誘導組、對照組miR-363相對表達量分別為0.32±0.02、1.00±0.31，Eomes mRNA相對表達量分別為15.73±0.85、1.00±0.22，兩組比較，P均<0.05。

2.2 兩組細胞Eomes蛋白表達比較 誘導組、對照組Eomes蛋白相對表達量分別為0.78±0.06、0.21±0.02，兩組比較，P<0.05。

2.3 細胞中miR-363與Eomes的關系 TargetScan顯示miR-363在Eomes mRNA的3′UTR上有一個脊椎動物間保守的靶位點，靶位點類型為7mer-m8，“context+score”百分數為95，其與靶位點互補情況良好。miRanda顯示miR-363與靶位點匹配的mirSVR得分為-1.135 0，表明miR-363與3′UTR結合情況良好。熒光素酶報告系統檢測結果顯示，miR-363能使3′UTR-pmirGLO的熒光素酶表達量下降為0.40±0.06，對照miRNA的3′UTRmu-pmirGLO熒光素酶表達量為1.06±0.02，轉染miR-363模擬物后其表達量為1.01±0.05，miR-363能夠靶向抑制Eomes mRNA表達。

3 討論

研究發現，HUMSCs誘導后能夠向神經細胞分化。Fu等[7]誘導HUMSCs發生神經細胞樣形態學改變，并能夠檢測到谷氨酸脫羧酶的表達，細胞受到谷氨酸刺激后能夠產生內向電流，表明細胞具備成熟神經元的某些特性。Ma等[8]應用丹參和β-巰基乙醇誘導HUMSCs，發現細胞出現典型的神經性形態學改變，并表達巢蛋白、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和β-Ⅲ-tubulin。Ding等[9]應用β-巰基乙醇、成纖維細胞生長因子、神經生長因子和腦源性神經營養因子誘導HUMSCs，發現誘導后的細胞能夠表達神經標志物GFAP和微管相關蛋白。本研究成功實現HUMSCs向神經樣細胞的誘導分化。

Eomes是神經發育中后期表達的重要轉錄因子，在神經祖細胞中高表達，推測其可在神經的誘導分化過程中起重要作用。因此，本研究選取Eomes作為目標蛋白，real-time PCR和Western blot檢測誘導后的神經樣細胞發現有Eomes的高表達，表明Eomes作為重要的神經轉錄因子參與了神經細胞的分化過程，提示其可作為神經樣細胞誘導分化的標志物之一。

miRNAs作為一類小的內源性非編碼RNA已被證實廣泛參與生命活動過程中基因表達的調控，Duan等[10]研究發現，應用DMSO和BHA能夠將大鼠骨髓間充質干細胞誘導分化為神經樣細胞，誘導后有NSE和Tau的高表達，而REST表達降低。應用基因芯片篩選發現誘導后有14種miRNAs的高表達，進一步應用雙熒光素酶報告系統發現miR-29a能夠靶向作用于REST 3′UTR抑制其表達。Zhuang等[11]將HUMSCs誘導分化為神經樣細胞，應用基因芯片篩選發現誘導前后有6種miRNAs表達差異明顯，miR-1290、miR-26b、miR-194和miR-124a高表達，而miR-4521、miR-543低表達，表明miRNAs參與了神經樣細胞的誘導分化過程。本研究檢測結果顯示，誘導組細胞miR-363表達降低，Eomes mRNA、蛋白表達升高，生物信息學方法發現miR-363與Eomes 3′UTR結合情況良好，miR-363能夠靶向抑制Eomes mRNA表達。可見隨著誘導分化時間的延長，Eomes蛋白表達逐漸增多，表明Eomes對細胞的誘導分化有積極意義，Eomes蛋白的高表達抑制了內源性miR-363的表達，miR-363能夠靶向作用Eomes 3′UTR負性調控HUMSCs神經樣細胞分化后Eomes的表達。

[1] Hsieh JY, Wang HW, Chang SJ, et al. Mesenchymal stem cells from human umbilical cord express preferentially secreted factors related to neuroprotection, neurogenesis, and angiogenesis[J]. PLoS One, 2013,8(8):e72604.

[2] Zhu SF, Zhong ZN, Fu XF, et al. Comparison of cell proliferation apoptosis, cellular morphology and ultrastructure between human umbilical cord and placenta-derived mesenchymal stem cells[J]. Neurosci Lett, 2013,541:77-82.

[3] Yang CC, Shih YH, Ko MH, et al. Transplantation of Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells from Wharton′s Jelly after Complete Transection of the Rat Spinal Cord[J]. PLoS One, 2008,3(10):e3336.

[4] Maltman DJ, Hardy SA, Przyborski SA. Role of mesenchymal stem cells in neurogenesis and nervous system repair[J]. Neurochem Int, 2011,59(3):347-356.

[5] Cardozo AJ, Gómez DE, Argibay PF. Neurogenic differentiation of human adipose derived stem cells: relevance of different signaling molecules, transcription factors, and key marker genes[J]. Gene, 2012,511(2):427-436.

[6] Chua JH, Armugam A, Jeyaseelan K. MicroRNAs: biogenesis, function and applications[J]. Curr Opin Mol Ther, 2009,11(2):189-199.

[7] Fu YS, Shih YT, Cheng YC, et al. Transformation of human umbilical mesenchymal cells into neurons in vitro[J]. J Biomed Sci, 2004,11(5):652-660.

[8] Ma L, Feng XY, Cui BL, et al. Human umbilical cord Wharton′s Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J]. Chin Med J(Engl), 2005,118(23):1987-1993.

[9] Ding DC, Shyu WC, Chiang MF, et al. Enhancement of neuroplasticity through upregulation of beta1-integrin in human umbilical cord-derived stromal cell implanted stroke model[J]. Neurobiol Dis, 2007,27(3):339-353.

[10] Duan P, Sun S, Li B, et al. miR-29a modulates neuronal differentiation through targeting REST in mesenchymal stem cells[J]. PLoS One, 2014,9(5):e97684.

[11] Zhuang H, Zhang R, Zhang S, et al. Altered expression of microRNAs in the neuronal differentiation of human Wharton′s Jelly mesenchymal stem cells[J]. Neurosci Lett, 2015,600:69-74.

(收稿日期：2016-09-26)

趙曉彬(E-mail: lywangxueqin@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.013

R342.22

A

1002-266X(2017)02-0042-03

2016-09-20)

受損脊髓的再生在脊髓損傷的治療中前景廣闊，

人臍帶間充質干細胞(HUMSCs)以取材容易和免疫原性低被廣泛作為組織工程的種子細胞[1,2]，可被誘導分化為神經樣細胞用于脊髓損傷的再生治療[3,4]。