過(guò)表達(dá)S100A13基因的甲狀腺癌TT細(xì)胞侵襲能力變化

劉暢，謝翠松，陶松桔，宋衛(wèi)紅

(郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州 423000)

過(guò)表達(dá)S100A13基因的甲狀腺癌TT細(xì)胞侵襲能力變化

劉暢，謝翠松，陶松桔，宋衛(wèi)紅

(郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州 423000)

目的 觀察過(guò)表達(dá)S100A13基因的甲狀腺癌TT細(xì)胞侵襲能力變化情況。方法 分別用pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1/NT-GFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TT細(xì)胞，構(gòu)建空載體pCDNA3.1/NT-GFP-TT細(xì)胞系(空載體組)和S100A13穩(wěn)定過(guò)表達(dá)甲狀腺癌TT細(xì)胞系(S100A13過(guò)表達(dá)組)，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察兩組細(xì)胞的侵襲能力，蛋白印跡法檢測(cè)兩組細(xì)胞酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1(FGF-1)、細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)、CD31蛋白表達(dá)。結(jié)果 S100A13過(guò)表達(dá)組、空載體組穿出基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)分別為(83.7±5.0)與(40.0±1.7)個(gè)，兩組比較P<0.01。S100A13過(guò)表達(dá)組、空載體組細(xì)胞FGF-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.224±0.124、0.837±0.152，Cyclin E蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.034±0.131、0.459±0.032，CD31蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.147±0.144、0.312±0.071，兩組比較，P<0.05或<0.01。結(jié)論 過(guò)表達(dá)S100A13基因的甲狀腺癌TT細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，這可能與S100A13促進(jìn)FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白表達(dá)有關(guān)。

甲狀腺癌；S100A13基因；細(xì)胞侵襲；酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1；細(xì)胞周期蛋白E

S100蛋白家族是一個(gè)有21個(gè)成員的鈣結(jié)合蛋白家族，在多種腫瘤中表達(dá)異常，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能。S100A13是S100蛋白家族中的重要成員之一，在腫瘤及炎癥等疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1(FGF-1)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的重要成員之一,其能夠刺激血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移，促進(jìn)膠原的水解與沉積，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。細(xì)胞周期蛋白E(Cyclin E)是G1期重要的周期蛋白,與細(xì)胞周期蛋白質(zhì)依賴激酶結(jié)合促進(jìn)pRB的磷酸化,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。CD31即血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1，是一種相對(duì)分子質(zhì)量為130 kD的跨膜糖蛋白，廣泛分布在血管的各種細(xì)胞上,尤其在培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的連接處存在高表達(dá)，可作為機(jī)體血管生成的標(biāo)志，可直接反映移植瘤的微血管生成情況。本課題組前期建立了S100A13穩(wěn)定過(guò)表達(dá)人甲狀腺髓樣癌細(xì)胞株(TT)，并證實(shí)S100A13基因?qū)T細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用[3]。本研究觀察了過(guò)表達(dá)S100A13基因的甲狀腺癌TT細(xì)胞侵襲能力變化，并探討其機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 TT細(xì)胞購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清(FBS)的F12K培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中靜置培養(yǎng)。兔抗人FGF-1單克隆抗體、抗人CD31單克隆抗體和Cyclin E單克隆抗體均購(gòu)于士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 分別用pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1/NT-GFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TT細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率達(dá)30%，并換用含有500 μg/mL G418的完全培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，連續(xù)篩選4周后形成陽(yáng)性細(xì)胞克隆，構(gòu)建空載體pCDNA3.1/NT-GFP-TT細(xì)胞系和S100A13穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TT細(xì)胞系。將空載體pCDNA3.1/NT-GFP-TT細(xì)胞系(空載體組)和S100A13穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TT細(xì)胞系(S100A13過(guò)表達(dá)組)培養(yǎng)于10%FBS+1%雙抗+RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。0.25%胰酶消化，2～3 d傳代1次。

1.3 細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。將預(yù)冷的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液按1∶6稀釋基質(zhì)膠，于每個(gè)直徑8 μm的Transwell小室中鋪加50 μL基質(zhì)膠稀釋液，再放置于37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜成膜。次日將已成膜的小室取出，于小室上腔中加入無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液100 μL，放置20 min，使基質(zhì)膠水化。分別取上述兩組細(xì)胞(100 μL)接種在小室的上腔，于下腔中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。將小室板置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～36 h后取出，用棉簽輕輕擦棄小室上層細(xì)胞，再用PBS液洗滌3遍。將小室置于4%多聚甲醛液中固定10 min，倒置晾干，0.1%結(jié)晶祡溶液染色20 min，PBS液清洗，倒置晾干，中性樹膠封片。將小室放置在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，于高倍視鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，再取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白檢測(cè) 采用蛋白印跡法。提取上述兩組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，F(xiàn)GF-1抗體、CD31抗體和Cyclin E抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。去除一抗，TBST洗膜3次，二抗(1∶1 000)、37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白熒光檢測(cè)試劑盒(Hyclone．Pierce)顯示結(jié)果于X線片。掃描蛋白條帶灰度值，進(jìn)行定量，以β-actin為對(duì)照。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為FGF-1、CD31蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 S100A13過(guò)表達(dá)組、空載體組穿膜侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(83.7±5.0)、(40.0±1.7)個(gè)，兩組比較，P<0.01。

2.2 兩組細(xì)胞FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 S100A13過(guò)表達(dá)組、空載體組細(xì)胞FGF-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.224±0.124、0.837±0.152，Cyclin E蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.034±0.131、0.459±0.032，CD31蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.147±0.144、0.312±0.071，兩組比較，P<0.05或<0.01。

3 討論

S100A13在心肌、骨骼肌、腦組織、胰腺、腎臟、子宮、小腸、甲狀腺等器官和組織中均有表達(dá)，特別在甲狀腺濾泡細(xì)胞中高表達(dá)。研究[4]發(fā)現(xiàn)，S100A13在乳頭狀甲狀腺癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。在黑色素瘤細(xì)胞中，S100A13通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子和NF-κB信號(hào)通路參與細(xì)胞周期進(jìn)展和分化[5]，且S100A13的表達(dá)狀態(tài)亦與黑色素瘤患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[6]。此外，S100A13高表達(dá)肺癌細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)[7]。在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血清中亦發(fā)現(xiàn)S100A13水平升高[8]。上述結(jié)果均表明，S100A13增高可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要預(yù)報(bào)器。侵襲為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的第一步，為了探討體外S100A13基因過(guò)表達(dá)在甲狀腺癌中的侵襲作用，我們建立了穩(wěn)定高表達(dá)S100A13基因的TT細(xì)胞系，研究S100A13基因過(guò)表達(dá)在體外對(duì)TT細(xì)胞侵襲能力的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S100A13穩(wěn)定過(guò)表達(dá)甲狀腺癌TT細(xì)胞較空載體pCDNA3.1/NT-GFP-TT細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多，表明S100A13過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)甲狀腺癌TT細(xì)胞的侵襲能力。

FGF-1是一種廣譜有絲分裂原與促血管生成因子，其通過(guò)激活纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9,10]。FGF-1不僅在正常發(fā)育與創(chuàng)傷愈合中扮演著重要角色，也在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)出癌基因樣作用[11]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)GF-1在食管腺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[12～14]，其與血管生成和腫瘤發(fā)生等過(guò)程密切相關(guān)，并在其中起重要作用[15]。FGF-1可促進(jìn)血管內(nèi)皮增生，促進(jìn)血管生成。研究[16]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌中S100A13蛋白表達(dá)明顯高于甲狀腺腺瘤和正常組織，其陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與FGF-1表達(dá)具有很好的一致性。本研究表明，與空載體組相比，S100A13過(guò)表達(dá)組FGF-1蛋白高表達(dá)。據(jù)此我們推測(cè)，S100A13基因過(guò)表達(dá)能顯著促進(jìn)TT細(xì)胞侵襲可能與FGF-1有關(guān)。Cyclin E基因在宮頸鱗癌、卵巢癌、消化道腫瘤、子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)增加[4,6,7]。其高表達(dá)可縮短G1期進(jìn)程，使細(xì)胞提前進(jìn)入S期，從而干擾DNA和中心體復(fù)制及分裂，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生成。研究證實(shí)，S100A13過(guò)表達(dá)組中Cyclin E蛋白高表達(dá)，S100A13增強(qiáng)甲狀腺癌TT細(xì)胞的侵襲能力可能與Cyclin E蛋白高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。CD31為機(jī)體血管生成的標(biāo)志，可直接反映移植瘤的微血管生成情況[14～18]，腫瘤誘導(dǎo)所產(chǎn)生的腫瘤血管網(wǎng)直接影響腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究中我們發(fā)現(xiàn)，S100A13過(guò)表達(dá)組CD31蛋白的表達(dá)明顯高于空載體組。因此，S100A13增強(qiáng)甲狀腺癌TT細(xì)胞的侵襲能力可能與CD31高表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成有關(guān)。

綜上可見，過(guò)表達(dá)S100A13基因的甲狀腺癌TT細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，這可能與S100A13促進(jìn)FGF-1、Cyclin E、CD31蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1] Prudovsky I, Mandinova A, Soldi R, et al. The non-classical export routes: FGF-1 and IL-1 alpha point the way [J]. J Cell Sci, 2003,116(24):4871-4881.

[2] Billottet C, Janji B, Thiery JP, et al. Rapid tumor development and potent vascularization are independent events in carcinoma producing FGF-1 or FGF-2[J]. Oncogene, 2002,21(53):8128-8139.

[3] 曹仁賢,田利娜,文芳,等.過(guò)表達(dá)S100A13基因?qū)谞钕侔㏕T細(xì)胞生長(zhǎng)特性的影響[J].癌癥,2008,27(8):822-824.

[4] Martinez-Aguilar J, Clifton-Bligh R, Molloy MP. A multiplexed, targeted mass spectrometry assay of the S100 protein family uncovers the isoform-specific expression in thyroid tumours[J]. BMC Cancer， 2015,15:199.

[5] Massi D, Landriscina M, Piscazzi A, et al. S100A13 is a new angiogenic marker in human melanoma[J]. Mod Pathol, 2010,23(6):804-813.

[6] Azimi A, Pernemalm M, Frostvik Stolt M, et al. Proteomics analysis of melanoma metastases: association between S100A13 expression and chemotherapy resistance[J]. Br J Cancer, 2014,110(10):2489-2495.

[7] Pierce A, Barron N, Linehan R, et al. Identification of a novel, functional role for S100A13 in invasive lung cancer cell lines[J]. Eur J Cancer, 2008,44(1):151-159.

[8] Smirnov DA, Zweitzig DR, Foulk BW, et al. Global gene expression profiling of circulating tumor cells[J]. Cancer Res, 2005,65(12):4993-4997.

[9] Grose R, Dickson C. Fibroblast growth factor signaling in tumorigenesis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005,16(2):179-186.

[10] Presta M, Dell′Era P, Mitola S, et al. Fibroblast growth factor/fibroblast growth factors receptor system in angiogenesis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005, 16(2):159-178.

[11] Prudovsky I, Mandinova A, Soldi R, et al. The non-classical export routes: FGF1 and IL-1alpha point the way[J]. J Cell Sci, 2003,116(Pt 24):4871-4881.

[12] Soslow RA, Nabeya Y, Ying L, et al. Acidic fibroblast growth factor is progressively increased in the development of oesophageal glandular dysplasia and adenocarcinoma[J]. Histopathology, 1999,35(1):31-37.

[13] Grose R, Dickson C. Fibroblast growth factor signaling in tumorigenesis[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005,16(2):179-186.

[14] 田利娜,曹仁賢,劉星,等.shRNA干擾S100A13基因?qū)θ思谞钕侔┘?xì)胞釋放成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1的影響[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2010,26(10):847-849.

[15] 趙仲生,茹國(guó)慶,馬杰.細(xì)胞周期素E和P53蛋白在胃癌組織中表達(dá)及預(yù)后意義[J].中國(guó)癌癥雜志,2003,13(3):211-214.

[16] 劉暢,曹仁賢,鐘警,等.甲狀腺癌組織中S100A13、FGF-1表達(dá)及意義[J].實(shí)用癌癥雜志,2009,24(1):19-20.

[17] 傅玉峰,丁炯.VEGF表達(dá)與胃癌生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,29(9):749-752.

[18] Shirakawa K, Kobayashi H, Sobajima J, et al. Inflammatory breast cancer: vasculogenic mimicry and it s hemodynamics of an inflammatory breast cancer xenograft model[J]. Breast Cancer Res, 2003,5(3):136-139.

湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計(jì)劃課題項(xiàng)目(B2014-176)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.02.012

R736.1

A

1002-266X(2017)02-0040-03