采油污水對(duì)斑馬魚(yú)SOD活性的影響

劉超群+吳楊+張薇+徐長(zhǎng)君+寶力德

摘要：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系統(tǒng)中重要的一種酶。通過(guò)研究采油污水對(duì)生物體內(nèi)SOD活性的影響，可以判斷采油污水對(duì)生物體產(chǎn)生的毒害以及對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的污染。本實(shí)驗(yàn)采用斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)比色法和酶液提取技術(shù)，以不同濃度的采油污水脅迫培養(yǎng)斑馬魚(yú)，然后測(cè)定斑馬魚(yú)的頭部、肌肉和內(nèi)臟中SOD活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在采油污水脅迫培養(yǎng)的斑馬魚(yú)體內(nèi)的sOD活性的變化與污水的濃度也就是污染物脅迫強(qiáng)度有著一定的關(guān)系。其中以斑馬魚(yú)頭部的SOD活性變化最為顯著，在無(wú)采油污水脅迫的對(duì)照組中斑馬魚(yú)頭部的SOD活性為16.73U/mg，而在采油污水稀釋濃度為0.03的全致死組中培養(yǎng)的斑馬魚(yú)頭部的SOD活性為239.09U/mg。說(shuō)明在沒(méi)有采油污水污染的情況下斑馬魚(yú)的SOD基礎(chǔ)活性比較低，在全致死濃度時(shí)其活性在斑馬魚(yú)頭部中上升了14倍左右，變化非常明顯。因此可以通過(guò)檢測(cè)斑馬魚(yú)頭部的SOD活性的變化去判斷斑馬魚(yú)是否受到水中污染物的毒害，進(jìn)而判斷環(huán)境污染的程度。為環(huán)境檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為采油污水的綜合化處理和環(huán)境污染的治理提供簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段。另外本研究發(fā)現(xiàn)在大慶地區(qū)采油污水中斑馬魚(yú)全致死濃度為該污水的33倍稀釋濃度，反映出目前大慶地區(qū)的水源被采油污水污染較嚴(yán)重。采油污水的排放質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，急需加強(qiáng)對(duì)采油污水的排放進(jìn)行治理，改善大慶地區(qū)水源環(huán)境質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：采油污水；斑馬魚(yú)；SOD；環(huán)境污染

中圖分類(lèi)號(hào)：X502 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095—672Xf2016）06—0072—05

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2016.06.016

引言

現(xiàn)今，隨著人類(lèi)對(duì)石油資源的不斷開(kāi)采，產(chǎn)生了大量的采油污水，并對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染。大慶作為我國(guó)重要的石油基地，同樣面臨著此種情況。為了保證石油的產(chǎn)量，新采油技術(shù)不斷的開(kāi)發(fā)，我國(guó)的石油污染狀況和性質(zhì)也發(fā)生了巨變。采油污水主要來(lái)自于石油生產(chǎn)過(guò)程中注采不平衡時(shí)所產(chǎn)生的污水，以及油氣集輸裝置檢修和沖洗管線時(shí)所產(chǎn)生的污水，該污水成分較復(fù)雜，其中的污染成分來(lái)源于采油生產(chǎn)的各個(gè)生產(chǎn)工序。采油污水中主要成分是：原油、地層中的鹽類(lèi)、氣體、懸浮物、化學(xué)藥劑、微生物等。采油污水是否會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染、對(duì)生態(tài)產(chǎn)生破壞，引起人們的廣泛關(guān)注。

斑馬魚(yú)（Danio rerio）是一種體型較小生活在熱帶的魚(yú)類(lèi)。其身體近似紡錘形，成年斑馬魚(yú)體長(zhǎng)約5cm，身體兩側(cè)有銀色斑紋，身體背部呈橄欖色，在身體的其他部位還有與其相同的斑紋。斑馬魚(yú)還具有繁殖快、數(shù)量多、便于獲取培養(yǎng)、易成活等優(yōu)點(diǎn)。水生生態(tài)環(huán)境的污染對(duì)斑馬魚(yú)產(chǎn)生的影響較明顯，故本實(shí)驗(yàn)選用斑馬魚(yú)作為檢測(cè)采油污水對(duì)水質(zhì)污染程度的生物檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)魚(yú)。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物防御系統(tǒng)中重要的一種酶，廣泛存在于動(dòng)、植物的細(xì)胞中，其功能主要是清除細(xì)胞中的超氧陰離子游離基，將其轉(zhuǎn)化為H₂O₂和O₂，再經(jīng)過(guò)氧化氫酶的作用轉(zhuǎn)化成水和氧氣。通常情況下在動(dòng)、植物體中處于動(dòng)態(tài)平衡。超氧化物歧化酶不僅可清除、阻止因氧游離基對(duì)動(dòng)、植物細(xì)胞造成的損害，還能夠及時(shí)修復(fù)被損害的細(xì)胞，并復(fù)原游離基對(duì)細(xì)胞造成的傷害。

當(dāng)生物體受到環(huán)境脅迫時(shí)，表現(xiàn)出SOD活性的變化，測(cè)定SOD活性的變化能推斷出生物體受到環(huán)境脅迫的程度。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來(lái)確定酶活性的大小。在有氧化物質(zhì)的存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O₂，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O₂，從而抑制甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低，反之酶活性愈高。在采油污水中脅迫培養(yǎng)的斑馬魚(yú)的SOD活性的變化，反應(yīng)出了采油污水對(duì)水生生物的毒害，進(jìn)而推斷出采油污水對(duì)水生生態(tài)環(huán)境的污染程度。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為斑馬魚(yú)，購(gòu)于大慶市讓胡路區(qū)博奧國(guó)際花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中規(guī)定實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)必須年齡相同、品種相同、大小相同、生理狀況相同，實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)必須顏色純正、活動(dòng)自如、無(wú)任何外傷、各項(xiàng)生理狀況等完全正常，任何有異常的魚(yú)都不可以作為實(shí)驗(yàn)魚(yú)。

1.2采油污水的稀釋

采油污水取于油田水處理聯(lián)合站。

取實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用清潔紗布，對(duì)采油污水進(jìn)行過(guò)濾，去除其它物質(zhì)，將最后得到的采油污水濃度規(guī)定為單位1，向其中加去離子水稀釋?zhuān)玫綕舛确謩e為0.01，0.04，0.07，0.10，0.13，0.16六組濃度，并對(duì)每組污水設(shè)置一組平行實(shí)驗(yàn)組。

1.2.1試劑的配制

（1）磷酸緩沖液（濃度為0.05 mol/L，pH值為7.8）：取濃度為0.1 mol/L，pH值為7.8的Na3P04緩沖液50mL，將其定容至100mL容量瓶中，充分混勻。并置于4℃冰箱中避光保存，以備后用。

（2）EDTA—核黃素混合液：取濃度為0.1mmol/L的EDTA試劑50mL將其與濃度為2mmol/L的核黃素試劑50mL混合，移入100mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）Met溶液：取0.3879g的Met粉末，用PBS緩沖液溶解并定容至100mL。

（4）NBT溶液：取0.1533g的NBT粉末，用100mL蒸餾水溶解并定容250mL。

（5）石英砂

1.3確定斑馬魚(yú)的致死、半致死濃度

用1000mL燒杯分別裝上述濃度的采油污水，每燒杯中培養(yǎng)8條斑馬魚(yú)。再取1000mL燒杯裝相同體積的去離子水分別培養(yǎng)8條斑馬魚(yú)，作為對(duì)照。把實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組燒杯中的水溫調(diào)至最適溫度值，從實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)中隨機(jī)抽取出斑馬魚(yú)，將其立刻投入燒杯中，每燒杯投入8條斑馬魚(yú)。設(shè)定一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期為96h，分別在在24h、48h、72h、96h的時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄斑馬魚(yú)的存活數(shù)量，并計(jì)算出死亡率，最后根據(jù)此數(shù)據(jù)得出斑馬魚(yú)的致死濃度和半致死濃度的大致范圍。斑馬魚(yú)是否死亡可根據(jù)是否有活動(dòng)跡象，比如是否呼吸、觸碰其身體后是否游動(dòng)等，從而判斷斑馬魚(yú)是否存活。

根據(jù)致死濃度和半致死濃度范圍在將此濃度范圍分成六個(gè)濃度梯度，進(jìn)一步縮小濃度范圍。最終確定斑馬魚(yú)的全致死濃度、半致死濃度和1/4致死濃度。

1.4酶液的粗提取

從實(shí)驗(yàn)燒杯中取出斑馬魚(yú)，在預(yù)冷的條件下，將斑馬魚(yú)的頭部、肌肉和內(nèi)臟分別稱(chēng)取0.4 g置于研缽中，加入預(yù)冷的2mL濃度為0.05mol/L的pH值為7.8的磷酸緩沖液，將其置于冰浴中研磨粉碎后，將其移入容量為10mL的離心管中，然后再用6mL濃度為0.05mol/L的pH值為7.8的磷酸緩沖液對(duì)其進(jìn)行沖洗，并一同倒入同一離心管中。將離心管置于離心機(jī)中于10000rpm下離心15min。然后將離心管中的上清液取出，移入10mL容量瓶中定容，然后將其置于4℃下保存，用于測(cè)定超氧化物歧化酶的活性。

1.5 SOD活性單位的測(cè)定

在560nm波長(zhǎng)下，測(cè)定不同酶液量的吸光值。通過(guò)計(jì)算得出抑制NBT光還原的相對(duì)百分率。以酶液用量為橫坐標(biāo)，以抑制NBT光還原相對(duì)百分率為縱坐標(biāo)，繪制出二者相關(guān)曲線。從而得出抑制NBT光還原相對(duì)百分率為50%時(shí)的超氧化物歧化酶的酶液量（μL），并以此規(guī)定為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.6 NBT法測(cè)定SOD活性

將待測(cè)組設(shè)置成1/4致死濃度（稀釋濃度為0.015）、半致死濃度（稀釋濃度為0.019）和全致死濃度（稀釋濃度為0.03）。并用去離子水做兩組相同對(duì)照。取0.3mL蛋氨酸+0.3mL EDTA—核黃素混合溶液+0.3mL NBT+1.5mL磷酸緩沖液（0.05mol/L，pH值為7.8）+0.1mL酶液，混勻。將對(duì)照組中的一組試管外側(cè)套上略長(zhǎng)于試管的避光錫紙。另一對(duì)照組置于正常實(shí)驗(yàn)條件下曝光。待其靜止大約25分鐘之后，置于560nm下，測(cè)定其OD值。重復(fù)進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

2結(jié)果與討論

2.1采油污水中斑馬魚(yú)致死濃度的確定

經(jīng)測(cè)定，斑馬魚(yú)的全致死濃度為0.03、半致死濃度為0.019、1/4致死濃度為0.015。

2.2 SOD活性

通過(guò)NBT法測(cè)定了在不同的采油污水濃度中培養(yǎng)的斑馬魚(yú)不同組織提取液中的SOD的酶活性，得出以下數(shù)據(jù)：

在圖1中分析了斑馬魚(yú)體內(nèi)各部位的SOD活性受不同濃度的采油污水脅迫的變化趨勢(shì)。

如表1和圖1所示，在相同的處理時(shí)間和環(huán)境條件下，隨著采油污水濃度的增加，斑馬魚(yú)體內(nèi)的SOD活性隨之增大。以斑馬魚(yú)頭部為例：對(duì)照組SOD活性為16.73U/mg、1/4致死組SOD活性為75.95U/mg、半致死組SOD活性為128.23U/mg、全致死組SOD活性為239.09U/mg。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采油污水對(duì)斑馬魚(yú)頭部的SOD活性影響最明顯，而內(nèi)臟中的SOD活性次之，肌肉中的SOD活性最小。這種結(jié)果可能是由于鰓是斑馬魚(yú)的呼吸器官，通過(guò)吸取水中的氧氣進(jìn)行呼吸，直接與體外環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，且斑馬魚(yú)頭部組織的細(xì)胞較易受到污染物的損傷，導(dǎo)致SOD活性增加。而斑馬魚(yú)內(nèi)臟中的心臟與肝臟作為斑馬魚(yú)生存的主要代謝中心和解毒中心。心臟的功能是推動(dòng)血液流動(dòng)，向組織和器官輸送足夠的血液，以供應(yīng)氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并帶走代謝的終產(chǎn)物（如二氧化碳、尿素和尿酸等），使細(xì)胞維持正常的代謝和功能。而肝臟對(duì)來(lái)自體內(nèi)和體外的非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，具有生物轉(zhuǎn)化作用。通過(guò)新陳代謝將它們徹底分解或以原形排出體外，從而起到解毒作用。在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為在采油污水濃度較低時(shí)，斑馬魚(yú)內(nèi)臟中的SOD活性變化較大。而隨著采油污水濃度的增加，進(jìn)入內(nèi)臟中的大量污染物會(huì)反過(guò)來(lái)抑制斑馬魚(yú)內(nèi)臟的代謝活動(dòng)，導(dǎo)致斑馬魚(yú)內(nèi)臟中的SOD活性的變化比在低濃度采油污水脅迫培養(yǎng)的斑馬魚(yú)內(nèi)臟中的SOD活性的變化小。采油污水中的大量污染物主要通過(guò)斑馬魚(yú)內(nèi)臟的代謝活動(dòng)進(jìn)入到斑馬魚(yú)的肌肉組織，所以，采油污水濃度的增加對(duì)肌肉中SOD活性的變化最小，且斑馬魚(yú)肌肉中的SOD活性的變化趨勢(shì)與內(nèi)臟中SOD活性的變化趨勢(shì)類(lèi)似，都是在采油污水濃度較小時(shí)，SOD活性變化較大，而隨著采油污水濃度的增加，SOD活性變化較小。

采油污水的污染造成了斑馬魚(yú)體內(nèi)各種細(xì)胞的損傷，并產(chǎn)生了更多的超氧陰離子游離基，機(jī)體為了消除這些超氧陰離子游離基，產(chǎn)生了SOD活性升高的現(xiàn)象。

3結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，隨著采油污水的濃度不斷增加，斑馬魚(yú)體內(nèi)的SOD活性增大。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同濃度采油污水脅迫培養(yǎng)后的斑馬魚(yú)體內(nèi)的SOD活性進(jìn)行分析，可知在無(wú)采油污水脅迫的對(duì)照組中斑馬魚(yú)頭部的SOD活性為16.73U/mg，而在采油污水稀釋濃度為0.03的全致死組中培養(yǎng)的斑馬魚(yú)頭部的SOD活性為239.09U/mg。說(shuō)明在沒(méi)有采油污水污染的情況下斑馬魚(yú)的SOD的基礎(chǔ)活性比較低，在全致死濃度時(shí)其活性在斑馬魚(yú)頭部中上升了14倍左右，變化非常明顯。因此可以通過(guò)檢測(cè)斑馬魚(yú)頭部的SOD活性的變化去判斷斑馬魚(yú)是否受到水中污染物的毒害，進(jìn)而判斷環(huán)境污染的程度，為環(huán)境檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為采油污水的綜合化處理和環(huán)境污染的治理提供簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段。另外本研究發(fā)現(xiàn)在大慶地區(qū)采油污水中斑馬魚(yú)全致死濃度為該污水的33倍稀釋濃度，反映出目前大慶地區(qū)的水源被采油污水污染較嚴(yán)重，采油污水的排放質(zhì)量不達(dá)標(biāo)，急需加強(qiáng)對(duì)采油污水的排放進(jìn)行治理，改善大慶地區(qū)水源環(huán)境質(zhì)量。