生附子煎煮過程中生物堿含量變化及水解機理

龔又明，鄧廣海，鄭顯輝，覃 軍，羅明超，王 芳

（1．廣東省中醫院藥學部，廣東 廣州 510120； 2．廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

·實驗研究·

生附子煎煮過程中生物堿含量變化及水解機理

龔又明1，鄧廣海1，鄭顯輝1，覃 軍1，羅明超1，王 芳2

（1．廣東省中醫院藥學部，廣東 廣州 510120； 2．廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

目的觀察生附子煎煮過程中生物堿成分含量的變化和水解，探索生附子煎煮減毒的機理。方法采用高效液相色譜（HPLC）法測定生附片煎煮前后7種成分的含量，比較其含量變化；采用新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿對照品模擬煎煮過程，考察不同溫度和水解時間對6種單、雙酯型生物堿含量的影響，觀察酯型生物堿煎煮前后水解程度，分析其降解率和穩定性，并確定其水解產物。結果生附片煎煮前后含量測定HPLC圖中確定8個色譜峰，生附片中3種雙酯型生物堿總量為1．756 mg／g，3種單酯型生物堿總量為0．724 mg／g，煎煮1 h后，其含量分別為0．026 mg／g和1．961 mg／g；對照品水解試驗HPLC圖中確定10個色譜峰，新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品50℃水解30 min，其降解率分別為18．72%，4．85%，28．91%，50℃水解1 h，其降解率分別為33．3%，6．99%，40．14%，100℃水解30 min以上，其降解率均為100．00%；苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿對照品50℃水解1 h后的含量基本不變，100℃水解1 h，其降解率分別為63．31%，42．36%，64．15%，100℃水解2 h以上，其降解率均為100．00%；根據對照品水解過程中的降解率大小，確定其穩定性大小依次為苯甲酰次烏頭原堿＞苯甲酰新烏頭原堿＞苯甲酰烏頭原堿＞次烏頭堿＞新烏頭堿＞烏頭堿。結論附子中雙酯型生物堿在50℃下即發生水解，100℃下30 min可水解完全，單酯型生物堿在50℃下較穩定，100℃下2 h即可水解完全。生附片煎煮過程是一個溶出與降解的動態過程，煎煮1 h后雙酯型生物堿基本消失。

生附子；生物堿；煎煮；水解規律；高效液相色譜

附子為毛茛科植物烏頭 Aconitum carmichaelii Debx． 子根的加工品，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效[1]，臨床應用的附子有生、熟之分，如《傷寒論》中含附子經方有20方，其中生用者達7方[2－3]。2015年版《中國藥典（一部）》附子項下僅收錄了鹽附子、黑順片、白附片、炮附片和淡附片5個品種，生附子未收錄其中[1]。一般認為，生附子毒性劇烈，經炮制減毒后方可入藥，但附子炮制過程中毒性降低的同時，有效成分也流失嚴重，如黑順片經過浸漂、煎煮蒸制等炮制程序，其生物堿流失70% ～80%[4－5]，嚴重影響臨床療效。生附子經過適量煎煮，不僅能保存附子有效成分，且其毒性成分含量也大大降低至與制附子相當[6－9]。陳平等[8]認為，長時間煎煮可明顯降低雙酯型生物堿和生物脂堿的濃度，是生附子煎煮減毒作用的主要理論依據。前期研究發現，生附子在煎煮過程中其酯型生物堿并非簡單的轉化過程，除了受飲片片型和浸泡時間的影響外，與溫度和煎煮時間更是密切相關。本研究中對生附片煎煮前后7種成分的含量進行測定，分析其毒性成分和有效成分，同時以6種單、雙生物堿對照品進行水解試驗，考察不同溫度和不同時間下酯型生物堿水解程度，確定其水解產物，從化學成分上探索附子中酯型生物堿的水解規律和生附子煎煮減毒增效機理。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1200型系列高效液相色譜儀（Agilent科技有限公司）；240型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯集團）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；DHG－9145A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）。

1．2 試藥

烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 0720－9807，110798－200404，799－9403，純度≥98%）；苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿對照品（成都瑞芬思生物有限公司，批號分別為 20141124，20141203，20140512，純度≥98%）；苯甲酸對照品（廣州番禺力強化工分廠，批號為20140821，純度≥99．5%）；生附片（廣州市藥材公司，批號為YPA3C0001），均經廣東省中醫院藥學部覃軍副主任中藥師鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx．子根的炮制品。四氫呋喃、乙腈為色譜純（德國Merck公司）；甲醇、鹽酸等試劑均為分析純（廣州化學試劑廠），水為超純水。

2 方法與結果

2．1 色譜條件[10]

色譜柱：迪馬Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：以乙腈－四氫呋喃（25∶15）為流動相A，以0．1 mol／L醋酸銨（每1 000 mL溶液中加入醋酸溶液0．5 mL）為流動性B，梯度洗脫（0～15 min，16% ～19%A；15～45 min，19%～22%A；45～60 min，22%～35% A；60～75 min，35%A）；柱溫：30℃；流速：0．8 mL／min；波長：235 nm；進樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

2．2．1 對照品溶液

稱取對照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用0．05%HCl－甲醇溶解并定容至刻度，配成苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿、苯甲酸（質量濃度分別為40．2，30．4，31．9，23．7，16．1，20．4，39．3 μg／mL）的混合對照品溶液。

2．2．2 供試品溶液

樣品供試品溶液：取生附片樣品粉末（過3號篩）1．0 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密移取異丙醇∶乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，氨試液3 mL，搖勻，靜置，稱定質量，放置過夜，連續超聲（功率250 W，頻率40 kHz）0．5 h，冷卻至室溫，再稱定質量，用異丙醇∶乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的質量，過濾，搖勻，精密吸取續濾液25 mL，于38℃減壓回收溶劑至干，精密吸取甲醇（含0．05%HCl）溶液5 mL溶解，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

煎煮液供試品溶液：稱取生附片樣品30 g，置500 mL圓底燒瓶中，加水300 mL，先浸泡30 min，100℃水浴加熱1 h，紗布濾過，藥渣加水240 mL，100℃水浴加熱0．5 h，紗布濾過，合并2次濾液，65℃減壓濃縮定容至300 mL，搖勻，精密移取4 mL，以3 000 r／min的速率離心10 min，將上清液加至已處理好的C18固相萃取小柱上（5 mL甲醇活化，4 mL水平衡），待其完全通過后，先用5 mL水洗滌，再用5 mL甲醇洗脫，整個洗脫過程控制流速約為0．5 mL／min。收集甲醇洗脫液，38℃減壓回收蒸干，精密吸取甲醇（含0．05%HCl）溶液1 mL溶解殘渣，濾過，即得。

水解試驗供試品溶液：分別精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品適量，用微量甲醇超聲溶解，然后用超純水定容至刻度，搖勻，分別配制成質量濃度為0．062，0．058，0．062，0．067，0．054，0．064 g／L的對照品溶液，分別精密移取1．5 mL，置5 mL容量瓶中，超純水定容至刻度，搖勻，反復操作5次。其中3種雙酯型生物堿分別于恒溫烘箱中0 h，50℃水解30 min，50℃水解1 h，100℃水解30 min，100℃水解1 h；3種單酯型生物堿分別于恒溫烘箱中0 h，50℃水解1 h，100℃水解1 h，100℃水解2 h，100℃水解3 h，放入冰浴中停止反應，冷卻至室溫后，用超純水補足至刻度，搖勻，即得。

表1 線性關系考察結果

2．3 方法學考察

標準曲線繪制：精密吸取混合對照品溶液適量，注入液相色譜儀，測定6種生物堿和苯甲酸的峰面積。結果以峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，得標準曲線、線性范圍及相關系數（R2）。結果見表1。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液適量，采用擬訂色譜條件進樣，重復測定5次。結果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿和苯甲酸峰面積的 RSD分別為0．45%，0．66%，0．47%，0．68%，0．89%，0．58%，1．02%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批生附片粉末（過3號篩）適量，按2．2項下方法制備供試品溶液，采用擬訂色譜條件，分別于0，4，8，16，24 h時各進樣10 μL。結果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿和苯甲酸峰面積的 RSD分別為1．42%，1．06%，1．31%，1．26%，1．24%，1．07%，1．52%(n＝5)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批生附片粉末（過3號篩）適量，按2．2項下方法制備供試品溶液，進行提取，采用擬訂色譜條件，分別進樣10 μL，重復操作5次，由標準曲線計算含量。結果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿和苯甲酸含量的 RSD分別為 1．33%，1．05%，1．28%，1．02%，1．08%，1．24%，1．56%(n＝5)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批已知含量的生附片粉末（過3號篩），精密稱定，按2．2項下方法制備供試品，進行提取，提取液中加入7種對照品適量，依法進行測定。結果苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿和苯甲酸的平均回收率分別為105．01%，102．62%，104．28%，99．43%，97．54%，98．69%，96．37%，RSD分別為 2．34%， 2．77%，3．02%，2．82%，2．99%，3．05%，3．12%。

2．4 樣品含量測定

精密吸取上述供試品溶液適量，按上述含量測定方法進行分析，測定6種生物堿和苯甲酸的含量。

2．5 水解機理探討

2．5．1 測定指標

在單個酯型生物堿的水解試驗中，本試驗中考察了溫度和水解時間對其含量及水解產物含量的影響，并計算其降解率（%）和轉化率（%）。

降解率（%）＝（水解前樣品含量－水解后樣品含量）／水解前樣品含量×100%。

轉化率（%）＝水解后樣品含量／完全水解后樣品含量×100%。

2．5．2 色譜峰確定和含量測定結果

由圖 1可見，3種酯型生物堿混合對照品水解液HPLC圖發現10個色譜峰（1～10號峰），與混合對照品溶液色譜圖比較，可鑒定1～4號峰分別為苯甲酸（benzoic acid， BA）， 苯 甲 酰 新 烏 頭 原 堿（benzoylmesaconine，BMC），苯 甲 酰 烏 頭 原 堿（benzoylaconine，BAC），苯 甲 酰 次 烏 頭 原 堿（benzoylhypaconine，BHC），8～10號峰分別為新烏頭堿（mesaconitine，MAC），次烏頭堿（hypaconitine，HAC），烏頭堿（aconine，AC）。根據新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿單一對照品水解液的HPLC分析結果，參考文獻[11－12]，可確認 5～7號峰分別為焦新烏頭堿（pymesaconitine，PMC），焦烏頭堿（pyraconitine，PAC），焦次烏頭堿（pyrhypaconitine，PHC）。

經測定，生附片中新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量分別為 0．584，0．195，0．977，0．314，0．082，0．328 mg／g。經常規煎煮后，其煎煮液中苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、次烏頭原堿的含量分別0．704，0．183 3，1．074，0．026 mg／g，苯甲酸含量為0．061 mg／g，新烏頭堿和烏頭堿含量未測得。可見，生附片不含焦烏頭堿類，主要含有雙酯型生物堿，經過煎煮后轉化為焦烏頭堿或單酯型生物堿，部分進一步轉化為醇胺型生物堿和苯甲酸。

圖1 混合對照品、3種雙酯型生物堿水解液和生附片煎煮前后高效液相色譜圖

2．5．2 水解試驗結果

由圖2可見，生附子中雙酯型生物堿在水和一定溫度下，可水解為單酯型生物堿，其中焦頭堿類是雙酯轉化為單酯生物堿的中間產物，性質不穩定，而單酯型生物堿進一步水解為醇胺型生物堿和苯甲酸，而醇胺型生物堿無紫外吸收，未測得。

由表2至表7可見，3個雙酯型生物堿在50℃的水溶液即發生一系列水解反應，新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品 50℃水解 30 min，其降解率分別為18．72%，4．85%，28．91%，50℃水解1 h，其降解率分別為33．3%，6．99%，40．14%，100℃水解30 min以上，其降解率均為100．00%；苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿對照品50℃水解1 h，其含量基本不變，100℃水解 1 h，其降解率分別為63．31%，42．36%，64．15%，100℃水解2 h以上，其降解率均為100．00%。根據酯型生物堿對照品水解過程中的降解率，其穩定性大小依次為苯甲酰次烏頭原堿＞苯甲酰新烏頭原堿＞苯甲酰烏頭原堿＞次烏頭堿＞新烏頭堿＞烏頭堿。結果見表2至表7及圖2。

3 討論

現代研究表明，附子主要含有水溶性和脂溶性生物堿類成分，脂溶性生物堿以C－19型二萜生物堿為主，具有強心、抗炎、鎮痛等作用，同時毒性劇烈，在水和加熱情況下可水解為毒性較低單酯型生物堿，而療效仍存；水溶性生物堿如 Higenamine，Coryneine，Chloride，Salsolinol，Uracil等，具有較強的強心作用[13]，其性質穩定，隨著煎煮時間的延長，其含量逐漸增加[8]，因此控制好單、雙酯型生物堿在煎煮過程中的水解程度是保證附子臨床安全性和有效性的關鍵。而生附子在煎煮過程中其酯型生物堿并不是簡單的轉化過程，除了受飲片片型和浸泡時間的影響外，與溫度和煎煮時間也密切相關。本研究中選擇了50℃和100℃ 2個溫度，50℃下雙酯型生物堿即可發生水解反應，100℃為常規煎煮溫度，單、雙酯型生物堿在該溫度下均可發生水解反應，選擇了0．5，1，2，3 h 4個時間，在該時間段下，可跟蹤酯型生物堿水解發生到完全水解的整個過程。

圖2 6種單、雙酯型生物堿對照品水解高效液相色譜圖

表2 新烏頭堿對照品水解液含量測定結果

表3 苯甲酰新烏頭原堿對照品水解液含量測定結果

表4 次烏頭堿對照品水解液含量測定結果

表5 苯甲酰次烏頭原堿對照品水解液含量測定結果

表6 烏頭堿對照品水解液含量測定結果

表7 苯甲酰烏頭原堿對照品水解液含量測定結果

匡海學[14]在《中藥化學》中論述，烏頭堿在100℃水解生成苯甲酰烏頭堿，在160～170℃生成烏頭原堿。然而試驗發現，雙酯型生物堿在50℃條件下即發生水解反應，首先轉化為焦烏頭堿類，即水解中間產物，然后進一步轉化為單酯型生物堿，而單酯型生物堿穩定性較好，在100℃條件下可發生水解反應，轉化為醇胺型生物堿（即烏頭原堿）和苯甲酸，2 h即可水解完全。根據6種酯型生物堿對照水解試驗中的降解率大小，發現其穩定性大小依次為苯甲酰次烏頭原堿＞苯甲酰新烏頭原堿＞苯甲酰烏頭原堿＞次烏頭堿＞新烏頭堿＞烏頭堿。該結論與生附片煎煮試驗結果一致，生附子煎煮過程是一個溶出和水解的動態過程，在100℃水溶液的煎煮過程中，一部分雙酯型生物堿在飲片內部發生水解反應，一部分逐漸溶出到水溶液中，再發生水解反應，一方面由于生附片中次烏頭堿含量最高，導致其溶出量也高，另一方面次烏頭堿性質較新烏頭堿和烏頭堿穩定，其降解率低，使得生附子煎煮1 h后還存留微量次烏頭堿，而不含新烏頭堿和烏頭堿。

根據生附子中酯型生物堿性質及其煎煮過程中的水解機理，生附子通過合理的煎煮，既能極大地保留其有效成分，也能降低其毒性，使之在臨床安全范圍。臨床中生附子使用劑量也不是越大越好，雖然通過煎煮可使附子中雙酯型生物堿轉化為單酯型生物堿，毒性降低，但是劑量過大易導致單酯型生物堿累積，而單酯型生物堿服用劑量過大也易引起中毒。因此，臨床醫師必須辨證論治，確定附子合適的劑量。同時，生附子煎煮時間的確定，除了與附子片型、浸泡時間有關外，也跟附子生物堿種類和含量高低相關，需要對其影響因素進行綜合評價才能確定最佳的煎煮時間。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫藥科技出版社，2015：291．

[2]陳務華，潘宗奇，陳秀玲，等．淺議《傷寒論》中生附子應用及臨床體會[J]．新中醫，2014，46（6）：240－241．

[3]郭麗麗．《傷寒論》《金匾要略方論》中附子臨床應用的規律研究[D]．廣州：廣州中醫藥大學，2009．

[4]洪 俐，游國均．附子炮制諸法利弊與臨床應用[J]．時珍國醫國藥，2007，18（11）：2836．

[5]周 林，李 飛，任玉珍，等．附子中生物堿含量與在膽巴液中浸泡時間變化規律的研究[J]．中國實驗方劑學雜志，2014，20（10）：44．

[6]黃志芳，唐小龍，羅 恒，等．HPLC－Q－TOF－MS分析附子的化學成分及煎煮過程中的變化規律[J]．中國實驗方劑學雜志，2015，21（1）：57－63．

[7]張意涵，楊昌林，黃志芳，等．附子煎煮過程中13種生物堿含量的動態變化規律研究[J]．藥物分析雜志，2015，35（1）：16－23．

[8]陳 平，陳益民，陳 佳，等．液相色譜－質譜法研究附子生物堿的煎煮減毒機理[J]．色譜，2013，31（11）：1087－1092．

[9]周思思，馬增春，梁乾德，等．基于UPLC／Q－TOF－MS分析附子煎煮過程中化學成分的變化[J]．中西醫結合學報，2012，10（8）：894－900．

[10]林 華，沈玉巧，鄧廣海，等．附子炮制品及其煎煮液6種生物堿的含量測定[J]．今日藥學，2014，24（10）：704－707．

[11]孫婷婷，欒立標．HPLC分離測定四逆湯中3種雙酯型生物堿及其 6種水解產物[J]．中國中藥雜志，2006，31（19）：1634．

[12]陳東安，易進海，黃志芳，等．附子煎煮過程中酯型生物堿含量的動態變化[J]．中國實驗方劑學雜志，2011，17（3）：64－68．

[13]吳克紅，唐力英，王祝舉，等．附子的化學和生物活性研究進展[J]．中國實驗方劑學雜志，2014，20（2）：212－220．

[14]匡海學．中藥化學[M]．北京：中國中醫藥出版社，2003：1106－1108．

Study on the Content of Alkaloid and the Raw of Hydrolysis of Radix Aconite Lateralis during Decocting Process

Gong Youming1，Deng Guanghai1，Zheng Xianhui1，Qin Jun1，Luo Mingchao1，Wang Fang2
（1．Department of Pharmaceutical，GuangdongProvincial Hospital of TCM，Guangzhou，Guangdong，China 510120； 2．School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong，China 510006）

Objective To observe the content of alkaloid of Radix Aconite Lateralis and the raw of hydrolysis，and toxicity reducing mechanism during decocting process．M ethods HPLC method was used to determine the content of seven components before and after decocting and compare the change of content；the boiling process was simulated，the degradation rate and stability of mesaconitine，hypaconitine，aconine，benzoylmesaconine，benzoylaconine，ben－zoylhypaconine were observed in different temperature and time，the degree of hydrolysis of ester－type alkaloids before and after decocting was observed，and the hydrolysate was determined．Results Eight peaks were identified in the HPLC chromatogram of Radix Aconite Lateralis before and after decocting；the total content of three digester alkaloids was 1．756 mg／g，and the total content of three kinds of monoester alkaloids was 0．724 mg／g，after boiling 1 h，those content were 0．026 mg／g and 1．961 mg／g；ten peaks were identified in the HPLC chromatogram of hydrolysis test of reference product，the degradation rate of mesaconitine，hypaconitine，aconitine when hydrolyzing 30 min at 50℃ were 18．72%，4．85% and 28．91% respectively，the degradation rate of them when hydrolyzing 1 h in 50℃ respectively，the degradation rate was 100．00% for 30 min or more in 100℃；the content of benzoylmesaconine，benzoylhypaconine，benzoylaconine when hydrolyzing 1 h in 50℃ were the same basically，the degradation rate of them when hydrolyzing 1 h in 100℃ were 63．31%，42．36%，64．15% respectively，the degradation rate was 100．00% when hydrolyzing 2 h or more in 100℃；according to the degradation rate of the reference substance，the results were evaluated as follows benzoylhypaconine＞benzoylmesaconine＞benzoylaconine＞hypaconine＞mesaconine＞aconine．Conclusion The diester－type alkaloids could be hydrolyzed at 50℃ and be hydrolyzable at 100℃ for 30 min，the monoester－type alkaloid is stable at 50℃ and could be hydrolyzed at 100℃ for 2 h；the decocting process was a dynamic process of dissolution and degradation，and the content of the digester－type alkaloid disappears after decocting for 1 h．

radix aconite lateralis；alkaloid；decocting；hydrolysis；HPLC

R282．4；R282．71

A

1006－4931(2017)04－0009－07

2016－11－05)

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．04．003

廣東省科技計劃項目[2016A040403104，20160403]。

龔又明，男，碩士研究生，主管中藥師，研究方向為中藥炮制與鑒定，（電話）020－81887233（電子信箱）4896318＠qq．com。

王芳，女，博士研究生，講師，研究方向為中藥學，（電話）020－39352169（電子信箱）fangzisunny＠126．com。