甲狀腺乳頭狀癌患者的癌組織、血漿中長鏈非編碼RNA NONHSAT037832表達觀察

孫愛軍，斯巖，劉指南，蔡晶昇，沈美萍

(1 南京醫科大學第一附屬醫院，南京210029；2徐州醫科大學附屬淮安醫院，淮安市第二人民醫院)

甲狀腺乳頭狀癌患者的癌組織、血漿中長鏈非編碼RNA NONHSAT037832表達觀察

孫愛軍1,2，斯巖1，劉指南1，蔡晶昇1，沈美萍1

(1 南京醫科大學第一附屬醫院，南京210029；2徐州醫科大學附屬淮安醫院，淮安市第二人民醫院)

目的 觀察甲狀腺乳頭狀癌患者的癌(PTC)組織、血漿中長鏈非編碼RNA (LncRNA) NONHSAT037832的表達變化。方法 58例PTC患者(PTC組)，其中伴有側頸區淋巴結轉移38例，不伴有側頸區淋巴結轉移20例，均行PTC切除手術，術前留取外周靜脈血分離血漿，術中留取PTC組織標本。25例甲狀腺腺瘤患者為對照組，術前留取外周靜脈血分離血漿，術中留取甲狀腺腺瘤組織標本。采用RT-PCR法檢測兩組PTC組織、血漿NONHSAT037832。結果 PTC組、對照組瘤組織NONHSAT037832的相對表達量分別為2.81±0.63、3.04±0.56，血漿NONHSAT037832的相對表達量分別為4.02±1.38、4.16±1.43，二者比較，P均>0.05。PTC組中側頸區淋巴結轉移、無淋巴結轉移者瘤組織NONHSAT037832的相對表達量分別為2.51±0.63、8.74±1.56，血漿NONHSAT037832的相對表達量分別為8.54±1.55、2.42±0.38，二者比較，P均<0.05。相關性分析顯示 PTC患者癌組織NONHSAT037832與血漿中NONHSAT037832表達呈正相關(r=0.882，P<0.001)。結論 PTC癌組織NONHSAT037832表達與血漿NONHSAT037832表達呈正相關，PTC伴側頸區淋巴結轉移患者血漿NONHSAT037832水平降低。

甲狀腺腫瘤；甲狀腺乳頭狀癌；長鏈非編碼RNA; 長鏈非編碼RNA NONHSAT037832；

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是最常見的甲狀腺癌類型，占甲狀腺癌的80%～90%[1，2]。長鏈非編碼RNA (LncRNA)是一類長度大于200 bps的非編碼多聚腺苷酸，不編碼蛋白質，主要由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成，其表達具有組織特異性[3，4]。目前LncRNAs已經成為基因表達調控水平的關鍵性調節分子。多種癌組織中可見LncRNAs特征性的表達異常[5]。NONHSAT037832是一種新發現的LncRNAs，目前關于NONHSAT037832在PTCA組織腫的表達報道較少。我們觀察了PTC患者的癌組織、血漿中NONHSAT037832的表達變化?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年6月～2016年6月間在南京醫科大學第一附屬醫院甲狀腺外科住院的PTC患者58例(PTC組)，其中男12例、女46例，年齡(45.23±14.14)歲；腫瘤直徑(12.56±7.45)mm；其中伴有伴側頸區淋巴結轉移者38例，不伴有伴側頸區淋巴結轉移中的20例；均行PTC切除手術，術后病理確診為PTC；術前留取外周靜脈血分離血漿，術中留取PTC組織。排除既往存在甲狀腺手術史、術前接受過放療或化療者、哺乳期婦女、存在嚴重心肺疾病及肝腎功能衰竭、患有其他惡性腫瘤者。另選擇25例甲狀腺腺瘤患者為對照組，其中男8例、女17例，年齡(47.54±15.26)歲；腺瘤直徑(28.4±10.23)mm；均行甲狀腺腺瘤切除術，術前留取外周靜脈血分離血漿，術中留取甲狀腺腺瘤組織。所有標本經液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存備用。兩組性別、年齡比例等臨床資料具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 兩組PTC組織、血漿NONHSAT037832檢測 總RNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技公司)，RT反轉錄試劑盒、實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)試劑盒(TaKaRa生物，中國)，NanoDrop 2000c紫外分光光度儀(美國賽默飛世爾公司)，7500 Fast型qRT-PCR儀(ABI公司，美國)。采用RT-PCR法。取兩組PTC組織、血漿，嚴格按照RNA提取分離試劑盒說明書操作步驟提取PTC組織、血漿LncRNA。用紫外分光光度儀測定提取RNA的濃度和純度。選取A260 nm/A280 nm在1.8～2.2的樣品用于后續試驗。以GAPDH作為內參。所有引物均由TaKaRa生物(大連，中國)合成。NONHSAT037832上游引物序列為5′-GCCAATGTCACCATGCACTC-3′，下游引物序列為5′-GCTGAGAGAACGTCAGCTCC-3′；GAPDH上游引物序列5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′?？偡磻w系20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqTM(2x) 10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L)0.4 μL,PCR Reverse primer(10 μmol/L)0.4 μL, ROX Reference Dye(50x) 0.4 μL， cDNA模板1 μL，ddH2O 7.8 μL。擴增條件為95 ℃，5 s；60 ℃，45 s，共40個循環。用7500 Fast System SDS 軟件計算Ct值。用2-ΔΔCt法表示NONHSAT037832的相對表達兩。重復3次，取平均值。

2 結果

PTC組、對照組瘤組織NONHSAT037832的相對表達量分別為2.81±0.63、3.04±0.56，二者比較，P>0.05； PTC組、對照組血漿NONHSAT037832的相對表達量分別為4.02±1.38、4.16±1.43，二者比較，P>0.05。PTC組中淋巴結轉移者、無淋巴結轉移者瘤組織NONHSAT037832的相對表達量分別為2.51±0.63、8.74±1.56，二者比較，P<0.05；PTC組中淋巴結轉移者、無淋巴結轉移者血漿NONHSAT037832的相對表達量分別為8.54±1.55、2.42±0.38，二者比較，P<0.05。

相關性分析顯示 PTC患者癌組織NONHSAT037832與血漿中NONHSAT037832表達呈正相關關(r=0.882，P<0.001)。

3 討論

近年，甲狀腺癌發病率逐年升高，且呈年輕化趨勢[2]。PTC是最常見的甲狀腺癌，易發生腫瘤轉移[3]。據報道30%～90%的甲狀腺癌患者會出現頸部淋巴結轉移，且發生淋巴結轉移的患者預后常較差[4～6]。此外，甲狀腺癌復發轉移的主要器官就是淋巴結，局部復發率高達31%[5]。因此猜測，部分甲狀腺癌患者在腫瘤發現進行手術時已出現淋巴結轉移，但早期淋巴結轉移并未被臨床發現。轉移淋巴結的早發現、早治療有助于降低甲狀腺癌切除術患者術后腫瘤復發率及病死率。目前超聲引導下的細針穿刺被廣泛用來檢測甲狀腺原發癌、轉移灶及復發灶[7]。但臨床中約有30%的細針穿刺報告顯示為“不確定性”。臨床上主要應用超聲、CT、FDG-PET/CT來發現轉移灶及復發灶，但是這些準確率較低且費用高[8,9]。因此，找到新的生物標志物來預測甲狀腺淋巴結轉移具有重要臨床意義。分子標志物已經成功應用于許多疾病的診斷和判斷預后的工具[10]。90%的哺乳動物基因組表達非編碼RNAs(ncRNA)，這些RNA轉錄但不翻譯成蛋白質。miRNA和LncRNA是ncRNA的兩種類型，這些RNA的異常表達在腫瘤的發生發展過程中起重要作用[11]。許多miRNA已經作為與PTC淋巴結轉移相關的生物標志，如miRNA2861、miRNA451；miRNA146b、miRNA221、miRNA222及miRNA-135b可作作為PTC侵襲性相關的標志[12]。近來許多研究表明LncRNAs在腫瘤發生與轉移方面扮演重要作用，如CUDR、LSINCT-5、PTENP1是胃癌診斷的潛在標志物[13]。POU3F3對鱗狀食管癌具有較高的診斷價值[14]。由于LncRNA片段大于200 bp，所以臨床一直對其在外周血中的循環穩定性存在質疑，但近來已有相關文獻[1]報道其在循環血中穩定存在，可能作為新的特異性腫瘤生物標志物。已有學者研究發現，LncRNA NONHSAT037832在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達較癌旁組織中表達顯著降低，且其水平降低與淋巴結轉移及腫瘤大小呈負相關[15]。本研究發現，PTC組瘤組織、血漿中NONHSAT037832的相對表達量低于對照組，但差異無統計學意義， PTC組中淋巴結轉移者癌組織、血漿NONHSAT037832的相對表達量均低于無淋巴結轉移者，且相關性分析顯示 PTC患者癌組織NONHSAT037832與血漿中NONHSAT037832表達呈正相關，說明血漿NONHSAT037832可作為篩選PTC患者伴淋巴結轉移的潛在血漿學指標。

綜上所述，PTC癌組織NONHSAT037832表達與血漿NONHSAT037832表達呈正相關，PTC伴側頸區淋巴結轉移患者血漿NONHSAT037832水平降低。但本研究的不足之處為樣本量小、隨訪時間短，進一步研究應擴大樣本量、延長隨訪時間。

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江蘇省衛生廳科研基金面上項目(H201203)。

沈美萍(E-mail: 349122679@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.025

R736.1

B

1002-266X(2017)19-0081-03

2017-02-28)