不同濃度NF-κB信號(hào)通路抑制劑SN50對體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1自噬體表達(dá)的影響

秦晗 ,徐宏志，龔永慶

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院,江蘇連云港222002)

不同濃度NF-κB信號(hào)通路抑制劑SN50對體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1自噬體表達(dá)的影響

秦晗 ,徐宏志，龔永慶

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院,江蘇連云港222002)

目的 觀察不同濃度NF-κB信號(hào)通路抑制劑SN50培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1中自噬體的表達(dá)變化。方法 將體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞MC3T3-E1分為實(shí)驗(yàn)1、2、3組和對照組。對照組不加藥，實(shí)驗(yàn)1、2、3組分別加入終濃度為6.25、12.5、25 μg/mL的SN50，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，行單丹( 磺)酰戊二胺(MDC)染色，熒光顯微鏡下觀察各組自噬體表達(dá)情況。結(jié)果 對照組成骨細(xì)胞MC3T3-E1未見明顯點(diǎn)狀分布的綠色熒光。實(shí)驗(yàn)1組可見少許點(diǎn)狀綠色熒光。實(shí)驗(yàn)2組點(diǎn)狀綠色熒光數(shù)量較多。實(shí)驗(yàn)3組可見大量的點(diǎn)狀綠色熒光顆粒散布于成骨細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞突起。對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組綠色熒光細(xì)胞比例分別為1.0%±0.2%、12.3%±1.5%、26.8%±2.4%、56.8%±5.5%。綠色熒光細(xì)胞比例對照組<實(shí)驗(yàn)1組<實(shí)驗(yàn)2組<實(shí)驗(yàn)3組，P<0.05。結(jié)論 NF-κB信號(hào)通路抑制劑SN50培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1中自噬體表達(dá)且呈劑量依賴性升高。

核因子κB；成骨細(xì)胞；自噬；自噬體

牙齒萌出是指牙齒由骨腔內(nèi)移動(dòng)至骨外、進(jìn)而突破牙齦, 直至達(dá)到功能頜的過程[1]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡是牙齒正常萌出通道形成的基礎(chǔ)，核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路是調(diào)節(jié)二者平衡的重要通路[2]，其通過調(diào)控RANK/RANKL表達(dá)，從而調(diào)節(jié)成骨、破骨細(xì)胞分化信號(hào)進(jìn)而影響牙齒萌出通道的形成，在牙齒萌出過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3,4]。但是NF-κB調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的機(jī)制尚不明確。新近有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB通路調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制可能和抑制細(xì)胞周期、激活自噬有關(guān)[5]，提示我們NF-κB調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化可能與自噬有關(guān)。本研究觀察了不同濃度NF-κB信號(hào)通路抑制劑SN50培養(yǎng)的成骨細(xì)胞MC3T3-E1中自噬體的表達(dá)變化。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 成骨細(xì)胞MC3T3-E1購于中科院上海

1.2 成骨細(xì)胞分組及SN50應(yīng)用方法 將成骨細(xì)胞MC3T3-E1用?- MEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞生長良好，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，以2×104/cm2的密度接種與已置入消毒蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組、對照組，每組6孔。對照組不加藥，實(shí)驗(yàn)1、2、3組分別加入終濃度為6.25、12.5、25 μg/mL的SN50，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞自噬體表達(dá)觀察方法 采用單丹( 磺)酰戊二胺(MDC)染色法。將MDC染色液按體積比稀釋10倍。每孔加入100 μL MDC染色液，室溫避光染色15～45 min后，棄去染色液，以300 μL的1×Wash Buffer洗3次，再以100 μL的collection buffer覆蓋細(xì)胞爬片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。激發(fā)濾光片波長355 nm。阻斷濾光片波長512 nm。

高倍鏡(400倍)下計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算綠色熒光細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

2 結(jié)果

對照組成骨細(xì)胞MC3T3-E1未見明顯點(diǎn)狀分布的綠色熒光。實(shí)驗(yàn)1組可見少許點(diǎn)狀綠色熒光。實(shí)驗(yàn)2組點(diǎn)狀綠色熒光數(shù)量較多。實(shí)驗(yàn)3組可見大量的點(diǎn)狀綠色熒光顆粒散布于成骨細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞突起。對照組、實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組綠色熒光細(xì)胞比例分別為1.0%±0.2%、12.3%±1.5%、26.8%±2.4%、56.8%±5.5%。綠色熒光細(xì)胞比例對照組<實(shí)驗(yàn)1組<實(shí)驗(yàn)2組<實(shí)驗(yàn)3組，P<0.05。

3 討論

牙齒的萌出是一個(gè)多因素過程，在這一過程中既有牙槽骨、牙胚的組織學(xué)改變, 又有破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、牙胚細(xì)胞等細(xì)胞學(xué)的改變, 還有多種細(xì)胞因子的參與，而且這些生物信號(hào)分子是通過細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間、基質(zhì)間的自分泌或旁分泌途徑來調(diào)控發(fā)育進(jìn)程[6,7]。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡是保證牙齒正常萌出過程的基礎(chǔ)，若這一平衡失調(diào)，則可能導(dǎo)致牙齒萌出障礙。牙齒萌出障礙是指牙齒萌出期已過而仍在頜骨內(nèi)未能萌出的牙齒，其代表性疾病為顱骨鎖骨發(fā)育不全(CCD)則是多數(shù)牙齒萌出永久性的延遲[8]。我們曾對CCD患者進(jìn)行血清檢測發(fā)現(xiàn)，在成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶血清骨特異性堿性磷酸酶(B-ALP)升高的同時(shí)，伴有破骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶-抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRCAP-5b)升高[9]。提示成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞不能協(xié)調(diào)分化可能是該類患者牙齒萌出障礙的主要原因。目前關(guān)于牙齒萌出障礙研究的重點(diǎn)主要集中于牙齒萌出過程中破骨細(xì)胞的數(shù)量和分化的相關(guān)分子機(jī)制的變化情況。相反，對于密切相關(guān)的成骨細(xì)胞如何啟動(dòng)分化誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的聚集、分化、促進(jìn)牙齒萌出通道的形成，以及在這過程中信號(hào)通路情況及是否伴有自噬的發(fā)生等分子調(diào)控機(jī)制的研究則相對較少。

NF-κB信號(hào)通路是骨量動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)的重要通路，其通過對RANK/RANKL表達(dá)的調(diào)控，調(diào)節(jié)成骨和破骨細(xì)胞的分子信號(hào)，在骨基質(zhì)的形成、發(fā)育和改建中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[10]。因此，同樣也是牙齒萌出通道形成過程中的關(guān)鍵信號(hào)通路。破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)主要由免疫細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞表達(dá)，通常以三聚體復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，可以被許多因素激活，包括炎性細(xì)胞因子、生長因子、免疫受體、細(xì)菌及其產(chǎn)物脂多糖、病毒與病毒蛋白及某些理化因素等[11]。破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子(RANK)是RANKL刺激破骨細(xì)胞分化、生存、融合與活化的唯一靶受體。RANK的活化能使細(xì)胞骨架重構(gòu)，改變破骨細(xì)胞的形態(tài)，如細(xì)胞的延展性、移動(dòng)性等，使破骨細(xì)胞移動(dòng)并黏附到骨吸收區(qū)域。位于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞細(xì)胞膜表面的RNAK與RNAKL結(jié)合后可促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與成熟[12,13]。在前期的研究中，我們圍繞牙齒萌出過程中破骨細(xì)胞和NF-κB信號(hào)通路開展了一系列的基礎(chǔ)和臨床研究。結(jié)果顯示RANKL的陽性信號(hào)廣泛表達(dá)于成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙髓成纖維細(xì)胞、牙周韌帶成纖維細(xì)胞、牙齦成纖維細(xì)胞、牙囊細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成釉細(xì)胞等多種牙齒、牙周相關(guān)細(xì)胞。體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑后其數(shù)量減少，活性降低，RANKL表達(dá)較對照組明顯減弱[14]。體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也同樣證明，加入NF-κB信號(hào)通路阻斷劑后，小鼠的牙齒萌出較對照組減慢，牙囊和頜骨周圍的RANKL表達(dá)較對照組明顯減弱[15]。驗(yàn)證了NF-κB信號(hào)通路可能是調(diào)控破骨細(xì)胞活化的重要通路，同時(shí)也證實(shí)破骨細(xì)胞抑制劑可能通過調(diào)節(jié)RANKL的表達(dá)、調(diào)控破骨細(xì)胞的分化，進(jìn)一步說明NF-κB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡、促進(jìn)牙齒萌出過程中具有重要作用。

新近有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑觸發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞分化的機(jī)制可能和抑制細(xì)胞周期、激活自噬有關(guān)[5]；另有研究發(fā)現(xiàn)自噬基因可以在牙齒發(fā)育過程中的不同部位表達(dá)，提示自噬可能參與了牙齒的發(fā)生、發(fā)育[16,17]。然而自噬在牙齒萌出過程中發(fā)揮怎樣的作用，以及自噬與牙齒萌出過程中成骨細(xì)胞、NF-κB信號(hào)通路之間存在一個(gè)怎樣的聯(lián)系？目前研究較少。眾所周知，自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑，是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的一種重要機(jī)制，在維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用[18]。自噬具有雙重作用，當(dāng)自噬適度激活時(shí)，可加速胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解，產(chǎn)生氨基酸等小分子物質(zhì)，抵抗能量不足，防止錯(cuò)誤蛋白堆積，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活；當(dāng)自噬過度激活時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞裂解，引起自噬性細(xì)胞死亡[19,20]。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體方式的不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬可分為三種主要方式：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，通常自噬指的是巨自噬。在巨自噬中，細(xì)胞漿中可溶性蛋白和變性壞死的細(xì)胞器被非溶酶體來源的雙層膜結(jié)構(gòu)所包裹，即自噬泡，并有自噬泡將其攜帶到溶酶體中降解[21，22]。自噬/大自噬在維持細(xì)胞的穩(wěn)定性、發(fā)育、細(xì)胞生存、衰老、免疫、腫瘤和神經(jīng)退行性變中發(fā)揮作用。但是直到目前，自噬參與這些作用的機(jī)制還不十分清楚。許多外界刺激(如饑餓、激素、手術(shù))和細(xì)胞內(nèi)刺激(如錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚，一些小細(xì)胞器的損傷)均可誘導(dǎo)自噬發(fā)生。

本研究在體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞內(nèi)加入不同濃度的NF-κB信號(hào)通路阻斷劑SN50，通過MDC熒光染色法和激光共聚焦顯微鏡下觀察點(diǎn)狀分布綠色熒光即自噬體的表達(dá)情況。本研究結(jié)果顯示，未加SN50組成骨細(xì)胞胞質(zhì)中未見明顯點(diǎn)狀分布的綠色熒光。隨著SN50濃度的增加，成骨細(xì)胞中點(diǎn)狀分布的綠色熒光體數(shù)和熒光強(qiáng)度均逐漸增加。在加入25 μg/mL的SN50組可以看到大量的點(diǎn)狀綠色熒光顆粒分布于成骨細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞突起。提示SN50阻斷成骨細(xì)胞NF-κB通路過程中自噬被大量的激活。這也進(jìn)一步說明NF-κB信號(hào)通路和自噬在成骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81500893)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.013

R965

A

1002-266X(2017)19-0045-03

2016-10-10)

細(xì)胞庫，MDC染色試劑盒購于美國Sigma公司，SN50購于美國Senta Cruz公司，胎牛血清和a-MEM培養(yǎng)基購于美國Invitrogen 公司。