Xpert Mtb/RIF技術在結核性腦膜炎診斷中的應用

范秀博，閆菊娥，李毓新，吉智，李妍

(1西安交通大學醫學部公共衛生學院，西安710061；2西安醫學院第二附屬醫院；3陜西省結核病防治研究所)

Xpert Mtb/RIF技術在結核性腦膜炎診斷中的應用

范秀博1,2，閆菊娥1，李毓新2，吉智2，李妍3

(1西安交通大學醫學部公共衛生學院，西安710061；2西安醫學院第二附屬醫院；3陜西省結核病防治研究所)

目的探討利福平(RIF)耐藥實時熒光定量核酸擴增技術，即Xpert 結核分枝桿菌(Mtb)/RIF 技術在結核性腦膜炎診斷中的應用價值。方法分別采用抗酸染色法、培養法、Xpert Mtb/RIF技術對34例核性腦膜炎、43例疑似結核性腦膜炎、20例非結核性腦膜炎患者的腦脊液進行Mtb檢測。結果34例結核性腦膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為1、2、8例，陽性率分別為2.94%、5.88%、23.53%；抗酸染色法與培養法檢測陽性率相比，Pgt;0.05；培養法與Xpert Mtb/RIF技術檢測陽性率相比，Plt;0.05；Xpert Mtb/RIF技術與抗酸染色法檢測陽性率相比，Plt;0.05。43例疑似結核性膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為0、1、6例，陽性率分別為0、2.33%、13.95%；抗酸染色法與培養法檢測陽性率相比，P=0.5；培養法與Xpert Mtb/RIF技術檢測陽性率相比，Pgt;0.05；Xpert Mtb/RIF技術與抗酸染色法檢測陽性率相比，Plt;0.05。20例非結核性腦膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養法、Xpert Mtb/RIF技術均未檢測到Mtb。結論Xpert Mtb/RIF技術檢測腦脊液中的Mtb更有助于結核性腦膜炎的診斷。

核酸擴增技術；Xpert結核分枝桿菌/利福平技術；結核分枝桿菌；結核性腦膜炎；腦脊液

結核病是一個重要的全球性問題。在我國，結核病患者的死亡率僅低于艾滋病患者的死亡率，結核病已成為第二大傳染病[1]。2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，全國活動性肺結核患者高達499萬例，每年新發肺結核患者約100萬例[2]。結核病的臨床表現形式多樣，不但包括肺結核還包括肺外結核，而肺外結核中又以結核性腦膜炎最為常見，占結核病的0.5%～1.0%[3]。結核性腦膜炎是由結核分枝桿菌(Mtb)通過淋巴系統或血液系統播散入腦而引起的腦膜、脊膜的慢性非化膿性炎癥。由于結核性腦膜炎的致死率、致殘率非常高，迫切需要一種能快速、準確檢測Mtb的方法，以便于結核性腦膜炎的及時確診。目前，國內外有文獻[4～7]報道了利福平(RIF)耐藥實時熒光定量核酸擴增技術，即Xpert Mtb/RIF 技術在肺結核和肺外結核診斷方面的應用。本研究采用Xpert Mtb/RIF技術對部分結核性腦膜炎、疑似結核性腦膜炎患者腦脊液中的Mtb進行檢測，同時用抗酸染色涂片和培養法對受檢標本標本進行檢測，并對檢測結果進行對比分析，探討Xpert Mtb/RIF技術在結核性腦膜炎診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2014年4月～2016年4月西安醫學院第二附屬醫院收治的結核性腦膜炎患者34例、疑似結核性腦膜炎患者43例、非結核性腦膜炎患者20例，其中男63例、女34例，年齡13～79歲。 結核性腦膜炎的診斷標準[8]：既往有結核病病史，急性或亞急性起病，慢性遷延性病程，出現頭痛、嘔吐等顱內壓增高癥狀和腦膜刺激征，腦脊液壓力明顯增高、淋巴細胞增多、氯化物和糖含量減低，影像學檢查見顱底腦膜及側裂池呈點狀或團塊狀明顯強化，伴有腦積水等改變。43例疑似結核性腦膜炎患者包括腦梗死13例、癲癇9例、腦積水6例、腦炎15例。20例非結核性腦膜炎患者包括病毒性腦膜炎8例、化膿性腦膜炎12例。

1.2 腦脊液Mtb檢測及藥敏試驗方法 所有受檢者于治療前留取腦脊液，分別用抗酸染色法、培養法及Xpert Mtb/RIF技術檢測Mtb，培養出的菌株做RIF平藥敏試驗。

1.2.1 Mtb檢測 ①抗酸染色鏡檢Mtb：采用離心濃縮法[9]處理腦脊液，腦脊液標本靜置2～4 h，取沉淀部分30 mL并置50 mL的無菌螺旋蓋離心管中，3 000 g離心20 min。棄上清，取沉淀物涂片。自然干燥，用火焰固定2～3次。采用萋尼抗酸染色法染色(萋尼氏染色液購自中國珠海貝索生物技術有限公司)并于鏡下觀察結果。根據涂片Mtb含量的多少[9]判為4+、3+、2+、1+、1～8條/300個視野、陰性6級(其中前5級判為陽性)。②培養法檢測Mtb：采用中和離心法[9]處理腦脊液，腦脊液標本靜置2～4 h，取沉淀部分30 mL并置50 mL的無菌螺旋蓋離心管中，3 000 g離心20 min。棄上清，保留重懸沉淀物于5 mL滅菌生理鹽水中，加入1～2倍體積的4% NaOH消化液，渦旋振蕩30 s，靜置15 min后在生物安全柜內打開螺旋蓋，加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，0.067mol/L)至40 mL，3 000 g離心20 min，棄上清，加入1～2 mL磷酸鹽緩沖液，混懸，接種。接種時以無菌吸管吸取上述處理液0.1 mL，均勻接種在2支羅氏培養基(購自中國珠海貝索生物技術有限公司)斜面上，保持斜面水平向上37 ℃培養24 h后，直立放置37 ℃繼續培養。接種后第3、7天觀察培養情況，此后每周觀察1次，并在分離培養結果記錄本上記錄Mtb生長結果。根據菌落生長占培養基斜面的比例[9]分為++++、+++、++、+、實際菌落數、陰性6級(其中前5級判為陽性)。③Xpert Mtb/RIF技術檢測Mtb：Gene Xpert Dx儀器、 Gene Xpert Mtb/RIF Cartridge檢測盒及SR(sample reagent)購自美國Cepheid公司。取1 mL腦脊液標本加入前處理管中，然后加入2倍標本體積的SR標本處理液，渦旋振蕩15～30 s，靜置15 min，使標本充分液化。打開反應盒，取2 mL處理后樣品由加樣孔緩慢加入反應盒，然后將反應盒放入檢測模塊，儀器開始進行自動化檢測。反應結束后，在檢測系統窗口下可直接觀察結果。GeneXpert Mtb/RIF系統以Mtb DNA拷貝的高低分為高、中、低、極低和未檢出5級(其中前4級判為陽性)。

1.2.2 藥敏試驗及菌種鑒定 藥敏試驗所用培養基均購自中國珠海貝索生物技術有限公司。采用比例法[11]。用接種環取一環培養基上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對制成1mg/mL菌懸液，梯度稀釋為10～2 mg/mL和10～4 mg/mL，接種到含RIF(40 μg/mL)的羅氏固體培養基和空白對照管培養基，37 ℃培養4周，觀察結果。每批藥敏試驗用H37Rv作為敏感對照，以評價含藥培養基質量；若對照培養基上生長的菌落數少于20個，則重復試驗。菌種鑒定與藥敏試驗同時進行，將1 mg/mL的菌懸液進行100倍稀釋，接種0.1 mL于對硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鑒別培養基上，37 ℃培養4周后觀察結果。耐藥百分比=(含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基上生長的的菌落數)×100%，耐藥百分比lt;1%為受試菌對該藥敏感、≥1%為受試菌對該藥耐藥。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。率的比較用χ2檢驗、校正χ2檢驗和確切概率法。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

34例結核性腦膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為1、2、8例，陽性率分別為2.94%、5.88%、23.53%；抗酸染色法與培養法檢測陽性率相比，χ2= 0.00，Pgt;0.05；培養法與Xpert Mtb/RIF技術檢測陽性率相比，χ2=4.22，Plt;0.05；Xpert Mtb/RIF技術與抗酸染色法檢測陽性率相比，χ2=4.61，Plt;0.05。

43例疑似結核性膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為0、1、6例，陽性率分別為0、2.33%、13.95%；抗酸染色法與培養法檢測陽性率相比(確切概率法)，P=0.5；培養法與Xpert Mtb/RIF技術檢測陽性率相比，χ2=2.49，Pgt;0.05；Xpert Mtb/RIF技術與抗酸染色法檢測陽性率相比，χ2=4.48，Plt;0.05。

20例非結核性腦膜炎患者的腦脊液用抗酸染色法、培養法、Xpert Mtb/RIF技術均未檢測到Mtb。

34例結核性腦膜炎患者、43例疑似結核性膜炎患者、20例非結核性腦膜炎患者腦脊液用抗酸染色法、培養法、Xpert Mtb/RIF技術檢測到Mtb者分別為11、7、0例，陽性率分別為32.35%、16.28%、0；結核性腦膜炎與疑似結核性膜炎患者相比，χ2=2.74，Pgt;0.05；疑似結核性腦膜炎和非結核性腦膜炎患者相比，χ2=2.20，Pgt;0.05；結核性腦膜炎與非結核性腦膜炎患者相比，χ2=6.25，Plt;0.05。

所有受檢對象的腦脊液通過培養，3例發現陽性菌株，菌種初步鑒定均為Mtb，比例法藥敏試驗結果均為RIF敏感。同時，3例經過Xpert Mtb/RIF技術檢測為RIF敏感。二種方法檢測結果一致。

3 討論

由于結核性腦膜炎患者病情輕重程度不同、就診階段不同、臨床表現多樣，加之腦脊液實驗室檢查特征性結果較少，導致確診結核性腦膜炎的難度較大。因此，腦脊液中檢測出Mtb仍然是確診結核性腦膜炎的金標準和重要手段。目前，用于結核性腦膜炎診斷的方法有腦脊液抗酸染色法和培養法，前者容易漏檢，后者出結果時間長(1～2個月)。隨著分子生物學手段的不斷發展，越來越多的新診斷技術應用于臨床，Xpert Mtb/RIF技術便是其中之一。該技術只需手工加入已處理的待測樣本，其余均由儀器自動操作判讀是否為Mtb及其是否對RIF耐藥，整個流程僅需 2 h。本研究利用Xpert Mtb/RIF技術檢測結核性腦膜炎患者的腦脊液標本，并與傳統的抗酸染色法、培養法相比較，探討其在結核性腦膜炎診斷中的應用價值。

Xpert Mtb/RIF檢測技術是一種半巢氏實時熒光定量PCR體外診斷技術，可對Mtb以及其RIF耐藥性進行檢測。該技術針對Mtb的rpoB基因81bp的RIF耐藥決定區序列設計引物、探針，可以檢測rpoB基因是否發生突變，從而判斷受檢標本是否對RFP耐藥[9]。據報道[10]，通常需Mtb達5 000 CFU/mL時抗酸染色法才能得到陽性結果，Xpert Mtb/RIF技術的臨床檢出限為131 CFU/ mL[11]。在本研究中，采用Xpert Mtb/RIF技術檢測結核性腦膜炎與疑似結核性腦膜炎患者的腦脊液，Mtb陽性檢出率分別為23.53%、13.95%，均高于抗酸染色法(2.94%、0)和培養法(5.88%、2.33%)的檢出率，與鄒月麗等[12]報道確診結核性腦膜炎組的23.68%和可能結核性腦膜炎組的18.18%接近。所有受檢者Xpert Mtb/RIF技術陽性檢出率為14.43%(14/97)，低于Tortoli等[7]報道的84.6%，其原因可能有以下幾點：①入選者腦脊液標本本身含菌量較低；②腦脊液標本中存在某些抑制因子；③入選的病例數較少。

本研究中有3例腦脊液培養陽性，菌種初步鑒定均為Mtb，比例法藥敏試驗和Xpert Mtb/RIF技術監測均顯示其對RIF敏感，結果一致率為100%，高于筆者之前的研究結果[13]。此次試驗由于腦脊液標本數量有限，加之培養法陽性率較低，最終可以和Xpert Mtb/RIF技術檢測結果作比較的RIF敏感/耐藥的結果較少。

近幾年，世界衛生組織及國家結核病參比實驗室推薦了多種結核菌快速檢測技術，如Xpert Mtb/RIF技術、CPA 恒溫技術、LAMP 恒溫技術等，使得結核病的診斷更加快速、準確、簡便。這些技術對痰標本具有較高的診斷價值，對于含菌量較低的肺外標本更具臨床意義。Xpert Mtb/RIF技術對Mtb的陽性檢出率明顯高于其他檢測方法，大大提高了其病原學診斷率，具有特異性強、敏感度高、快速、簡便，且能同時檢測出Mtb是否對RIF耐藥等特點，在結核性腦膜炎的診斷和治療中具有重要的應用價值，可在資源豐富的地區作為一種常規方法大力推廣，使其在肺外結核病的診療中發揮重要作用。

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B

1002-266X(2017)43-0061-03

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閆菊娥(E-mail： 55709810@qq.com)

2017-05-31)