提高血凝與血凝抑制試驗檢測精確率的探討

劉 偉

福建省石獅市動物衛生監督所 福建石獅 362700

提高血凝與血凝抑制試驗檢測精確率的探討

劉 偉

福建省石獅市動物衛生監督所 福建石獅 362700

血凝與血凝抑制試驗作為多種動物疫病抗體檢測的手段，在基層動物疫病預防控制機構檢測工作中被廣泛應用，同時在疫病監測、免疫狀態評價、流行病學調查以及群體診斷中都具有重要的意義。因此，總結分析血凝與血凝抑制試驗，提高檢測精確率，避免出現錯誤結論就顯得尤為重要。文中從影響HA、HI試驗檢測結果的因素出發，分析總結提高檢測精確率的方法，供大家參考。

血凝與血凝抑制 禽流感 新城疫

1 緩沖液

1.1 緩沖液的種類 血凝和血凝抑制試驗所涉及的試驗不同，使用的緩沖液有所區別。常見的緩沖液有生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（PBS）。

濃度85%的生理鹽水常被用作禽流感抗體檢測的緩沖液，鹽濃度超過85%易使紅細胞受到非特異性凝集，而生理鹽水緩沖液不具備維持反應系統pH值的能力，而PBS卻具備該項功能。使用PBS進行禽流感抗體檢測所測得的抗體效價比使用生理鹽水測得的要高，能提高檢出率[1]。所以，禽流感HA、HI試驗盡量使用磷酸鹽緩沖液，可提高檢出率，避免出現非特異性凝集。通常配置PBS使用的Na2HPO4含有水分子，此時應注意用量，同時滅菌后還要再次進行pH值的調整。

PBS也常作為新城疫抗體檢測的緩沖液。但使用pH值為5.8～6.2的PBS，會導致紅細胞自凝和出現凝集圖像不清晰的結果。使用pH值5.8～7.2的PBS沒有使用同一pH值生理鹽水的效果好，生理鹽水不會出現自凝、圖像不清等缺點[2]。因此，可把生理鹽水作為緩沖液進行新城疫抗體檢測。

1.2 緩沖液的pH值 無論是哪一種緩沖液，pH值都必須限定好適用范圍。病毒血凝性的最適pH值在6.0～7.2。使用PBS時，pH值小于5.8，紅細胞可發生聚集結塊或破裂溶血，pH值大于7.8，聚集的紅細胞會加速解聚，病毒會輕易地從吸附的紅細胞上脫落；使用生理鹽水時，如果pH值小于6.4或大于7.2，紅細胞可能破潰溶血[3]。 綜上所述，6.0＜pH＜7.2是PBS進行試驗最適合的范圍，6.4＜pH＜7.2是生理鹽水進行試驗最適合的范圍。因此，為了避免對試驗結果的誤判，緩沖液的pH值可統一限定在6.4～7.2，而pH值在7.0～7.2時，血沉最充分，圖像辨識度最高，觀察也最簡單，結果判斷也最準確[4]。同時考慮pH計或pH試紙的誤差，可把緩沖液的pH值設在7.0，這也在長期的檢測工作中得到有效驗證。

1.3 緩沖體系的統一 試驗過程中每一個步驟都必須使用同一種緩沖液，保證緩沖體系一致，尤其是在配制1%雞紅細胞時，切不可為了方便使用生理鹽水，而應該依據試驗所需的緩沖體系進行操作。

2 溫 度

溫度在4～37℃時，每提高5℃，HI效價平均上升0.35log2[5]。當環境溫度不高于4℃時，不僅反應慢以至需要延長反應時間，而且紅細胞會發生聚集；環境溫度高于37℃及以上時，抗原能釋放神經氨酸酶，破壞紅血球表面，從而使之失去聚集能力從紅血球上脫落，紅血球則血沉過快同時更容易發生溶血，溫度過高還面臨液體蒸發過快導致反應體系總量和各組分比例失調的后果，這都會導致抗原活性下降，從而使得試驗不成立。試驗最適宜的溫度范圍在18～22℃[6]，試驗開始前尤其是夏季應把環境溫度平衡到該范圍。

3 時 間

3.1 HA試驗的有效時間和判定 測定血凝效價后不能繼續做HI試驗的情況有：隔天進行HI試驗、更換了紅細胞懸液、更換了抗原，這三種情況都必須重新測定血凝效價。HA試驗一般在加入紅細胞20 min后，隨時觀察結果，直到對照孔100%凝集，空白對照孔中液體澄清透亮，再進行結果判定。

3.2 HI試驗的孵育時間和判定 HI試驗的孵育時間與孵育溫度成反比，試驗最適宜的溫度是18～22℃，在該溫度范圍內，孵育20～40 min。若孵育時間短，血清中的抗體與抗原反應不徹底，凝集不完全，且之后紅細胞會與血清中的抗體競爭抗原；若孵育時間長，抗原會釋放神經氨酸酶，使凝集的紅細胞脫落或紅細胞裂解。所以，孵育20 min后，以陰性對照孔完全沉淀、陽性對照孔凝集為信號，隨時觀察結果。淚滴完全流淌，且以與對照孔淚滴大小、淚痕線粗細、淚痕流速快慢相近的最后孔為判定結果[7]。

4 紅細胞

4.1 紅細胞的采集 通常情況采集1羽禽的紅細胞可能出現自凝，所以一般采集至少3羽無免疫、健康禽的抗凝血液。采集時，抗凝劑使用過少，血液會凝集成塊，導致出現凝集價低、凝集抑制價高的誤判；抗凝劑使用過多，會抑制凝集，導致出現凝集價高、凝集抑制價低的結果?？鼓齽┡c血液的最佳比例是（1∶4）～（1∶5）[7]。 條件允許的情況下，可以使用含檸檬酸鈉抗凝劑的一次性真空采血管，以提高檢測的精確性。

4.2 禽種的選擇 檢測禽類血清抗體時，用同種禽類紅細胞基本上不出現非特異性凝集；檢測水禽血清抗體時，用雞紅細胞就可能出現非特異性凝集，出現假陰性[4]。因此，檢測禽類血清抗體時最好采集同種禽類的血液。

4.3 紅細胞的洗滌 在基層工作中我們很難判斷采集紅細胞的禽類是否健康和有無免疫，因此，采集來的血液要適當增加洗滌次數，以洗去血清中固有的抗體和雜質。采集的3份紅細胞可先分別進行3次洗滌，盡量洗去白細胞膜，然后把洗滌好的3份紅細胞進行混合，再進行洗滌，洗滌次數不宜過多，離心轉速按標準文件設定，直至上清液澄清、透明即可。離心管有“U”型和“V”型兩種，最好選擇后者，因為前者會使紅細胞沉淀不完全，導致洗滌效果不好。有的紅細胞血沉較慢，會導致試驗結果誤差很大，因此，制備好的紅細胞，一定要先觀察血沉，血沉過慢的應當重新制備[8]。

4.4 紅細胞的配制 去除紅細胞離心管的上清液后，吸取X mL緩沖液加入到紅細胞泥中，充分混勻后回抽（X+Y）mL，這時回抽液中就含有Y mL紅細胞，就可以配制出（100×Y）mL的1%紅細胞懸濁液，0.5%的紅細胞懸濁液以此類推。根據檢測樣品數就可以推算出需要回抽多少毫升的紅細胞。

5 抗 原

目前基層使用的抗原基本上都是凍干粉，所以，抗原方面只需要做好抗原效價的測定以及抗原效價的返滴定即可，返滴定可對不準確的效價進行校正。按照測定的抗原效價，進行效價±1共三種梯度的返滴定，選取使1單位抗原完全凝集、1/2單位抗原完全抑制的抗原梯度作為配制4單位抗原的效價。由于凍干粉原液中的各種成分依然存在于凍干粉中，所以，配制抗原用滅菌水稀釋凍干粉就可以了，否則可能導致抗原鹽類濃度過高，出現鹽類凝集、抗原效價不準確等現象。

6 操 作

試驗操作時吸頭要壓實緊密，指壓力度要均勻，吹打要慢吸快注，避免氣泡和溢出，同時要避免吸頭與反應板底部摩擦，造成的底部磨損會導致淚滴流淌不順暢、圖像不清晰。樣品、陽性血清、抗原和紅細胞懸液在使用前要搖勻，加入紅細胞反應后要使用振蕩器平穩、勻速振蕩混勻，時間在10 s左右即可。加紅細胞時，從最后一孔向前加，可以平衡各孔的反應時間。要避免把反應板放在空調出風口的方向上，以免反應體系的液體蒸發過快。

[1]許連珍.HA、HI微量法檢測雞群抗體的影響因素[J].中國家禽,2006,28(18)：31-32.

[2]張波,閻紅,莊艷.實驗室操作過程中影響血凝抑制試驗的因素[J].現代畜牧獸醫,2006(10)：44.

[3]閆玲.幾種試驗條件對雞新城疫血凝和血凝抑制試驗的影響[J].黑龍江畜牧獸醫1995(6)：25-26.

[4]杭柏林,胡建和,劉麗艷,等.影響血凝抑制試驗因素的研究進展[J].貴州農業科學,2009,37(3)：111-113.

[5]雷莉輝.影響血凝試驗和血凝抑制試驗的因素分析[J].中國畜牧獸醫,2013,40(6)：244-246.

[6]楊文,孫文梅,江燕萍.HI試驗中應注意的問題[J].上海畜牧獸醫通訊,2002(3)：31.

[7]宋建國,周峰.影響血凝和血凝抑制試驗因素的探討與分析[J].國外畜牧學豬與禽,2015,35(10)：59-61.

[8]黃愉森,莊克,謝淑敏.不同種禽類紅細胞懸液對HI結果的影響[J].養禽與禽病防治,2005(1)：8-9.

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1003-4331（2017）06-0034-02