循環腫瘤細胞檢測技術在非小細胞肺癌中的研究進展

謝升龍，薛 洋，叢 偉，△

(1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院胸外科，四川 成都 610000)

*通訊作者

循環腫瘤細胞檢測技術在非小細胞肺癌中的研究進展

謝升龍1，薛 洋2，叢 偉1，2△

(1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院胸外科，四川 成都 610000)

肺癌是我國發病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，傳統的診斷方法主要有病理組織學檢查、影像學方法和腫瘤標志物檢測。近幾年的研究發現，外周血循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)檢測可用于實時、無創地進行組織學鑒定，可能成為肺癌早期診斷、復發檢測、療效評估的一個重要手段。以下對肺癌中循環腫瘤細胞檢測技術進行綜述。

循環腫瘤細胞；肺癌；早期診斷；復發監測；療效評估

支氣管肺癌(簡稱肺癌)是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年死亡人數達140萬，占所有惡性腫瘤死亡人數的80%[1]。2011年中國惡性腫瘤發病率第1位是肺癌，每年新發病例約65萬，惡性腫瘤死亡率第1位也是肺癌，每年死亡病例約52萬[2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌80%以上，由于肺癌早期診斷方法的限制，我國約75%的肺癌患者在診斷時已屬晚期，5年生存率約為15.6%，而早期肺癌5年生存率能達到66.7%[3]。因此，肺癌的早期發現、早期診斷、早期治療顯得尤為重要。目前，臨床上對于肺癌的診斷、監測、療效評估主要依賴于病理組織學檢查、影像學方法和腫瘤標志物檢測，難以在早期發現腫瘤，也無法在早期發現腫瘤的轉移和復發以及治療效果的評估。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)指來源于實體瘤的腫瘤細胞，在不斷增殖過程中具有侵襲性，細胞脫離腫瘤組織通過上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)進入循環系統，成為具有侵襲轉移能力的CTCs。血液中出現CTCs是腫瘤可能發生遠處轉移的信號，CTCs檢測可比影像學檢查、病理組織學檢查、血清腫瘤標志物檢測更早發現人體內的腫瘤細胞，是一種簡便易行、可重復操作、微創的新型檢測手段。

1 肺癌CTCs概述

CTCs是1869年由澳大利亞內科醫生Thomas Ashworth首次通過顯微鏡在一名死于轉移瘤患者體內的外周血中發現的，這種在外周循環中存在的與原發腫瘤類似的細胞稱為CTCs[4]。由于受限于當時的科學技術和醫學技術的發展，這種在外周血中發現的腫瘤細胞并沒有被醫學界充分重視。直到本世紀初，隨著醫學科學技術的發展，通過使用先進的醫學設備才得以發現CTCs的臨床使用價值。多項臨床研究發現[5～7]CTCs檢測技術能在肺癌的輔助診斷、復發監測、療效評估方面發揮重要的臨床價值。

在過去的幾十年里，對于NSCLC的治療，化療基礎之上的綜合性治療得到了飛速的發展。而肺癌驅動基因突變的發現，使得醫學界對于NSCLC的分類得到了重新的認識，同時改變的還有非小細胞肺癌的治療[8]。基于表皮生長因子受體(epidermalGrowth Factor Receptor，EGFR)突變和間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)基因重組，也已成功的研發出了相對應的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhabitors，TKIs)靶向治療藥物。基于其他驅動基因突變(如ROS、MET、RET、BRAF)也有了相對應的治療策略。但是，涉及驅動基因突變的個體化治療的患者在整個非小細胞肺癌患者中只占到了一小部分，還有絕大部分患者依靠目前的檢測手段無法找到合適的個體化治療方案或者對現存的個體化治療方案耐藥。

2 CTCs的檢測方法

由于CTCs在其外周血中的數量很少，每105～107個有核細胞中才有一個CTCs[9]，因此對CTCs 的檢測技術要求更為準確、敏感。CTCs的檢測方法主要分為兩部分：CTCs富集技術和CTCs檢測技術。目前，CTCs檢測方法有很多種，但是，理想的檢測方法應該是：高度敏感、高度準確、易于操作。

2.1 CTCs富集技術 CTCs檢測的富集技術主要基于CTCs的生物學特性和物理學特征(如CTCs的大小、密度、帶電性、可變形性、細胞表面蛋白、生存能力和侵襲性)進行富集。目前常見的富集方法有：①密度梯度離心法：利用商品化的分離液，將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，根據血液中各種細胞的密度不同，離心后各種細胞成分分層，從下向上依次為：紅細胞、中性粒細胞、分離液、單個核細胞 (包括CTCs)，最上層是血漿，為防止離心前血細胞與分離液混合而不利于分離，建立了OncoQuick 方法，用一種專用的50 ml試管，在分離液與血液之間放置多孔屏障，這種方法的局限性是部分腫瘤細胞可遷移至血漿層或在離心管底部形成非特異性的聚合物而丟失 CTCs[10]。②免疫磁珠法：免疫磁珠分離技術是目前比較常用的CTCs分離和富集技術。他的原理是基于CTCs主要表達上皮源性表面標志，利用抗原抗體方法分離和富集CTCs，具體分為陽性富集方法和陰性富集方法。前者通過磁珠偶聯上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM)和細胞角蛋白(cytokerins，CKs)等標志直接富集外周血中上皮來源的循環細胞。后者通過磁珠偶聯CD45等白細胞標志，去除外周血白細胞而間接富集稀有上皮細胞。目前基于免疫磁性原理富集或同時檢測CTCs的技術主要有CellSearch系統、免疫磁性細胞分選儀(magnetric cell sorting，MACS)，AdnaTest癌細胞檢測系統和萊爾系統等[11]。③膜過濾法：膜過濾法主要基于腫瘤細胞的尺寸一般較大的特點(平均直徑超過8 μm)[12]。腫瘤細胞尺寸分離 (isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)技術，主要是利用腫瘤細胞直徑一般大于正常細胞的物理特性來分離CTCs。將血液通過孔徑為8 μm的濾膜過濾，正常細胞濾過而CTCs聚集于濾膜上，從而達到富集作用。然而，外周血中單核細胞大小跨度較大，直徑可達17 μm左右。因此，此方法不僅可能會漏掉直徑較小的CTCs，更可能捕獲較大的白細胞，從而使得其靈敏性及特異性下降[13]。

2.2 CTCs檢測技術 CTCs的檢測技術則是對CTCs表達的特異性組織蛋白或者mRNA進行檢測。目前的方法有：①配體靶向PCR技術(ligand-targeted PCR method，LT- PCR)：這種檢測技術是我國首創的檢測技術，他的基本原理是肺癌患者的CTCs表面會過量表達某些特異性受體，如葉酸受體(folate receptor，FR)，靶向PCR運用的配體類似物交聯核苷酸片段作為檢測探針，通過細胞表面特異性受體與其配體類似物的結合以實現探針與CTCs的結合，從而將CTCs的數目轉化為探針的數目，然后通過對探針的PCR定量檢測來計算CTCs的數目。由于具有受體配體結合(1個CTCs表面存在上萬個特異性受體)及PCR的兩次信號放大，從而可使1個CTC信號放大約1012倍。因此，配體介導的靶向PCR法，具有超高的靈敏度的特點，從而使早期肺癌中探測CTCs成為了可能[14]。②逆轉錄-聚合酶鏈反應法(reverse- transcriptase PCR，RT-PCR)：RT-PCR檢測技術是通過檢測上皮源性腫瘤細胞的mRNA以達到對CTCs檢測的目的。這種技術能夠將血循環中數量極低的mRNA通過聚合酶鏈反應，使檢測底物數量呈指數增長，再進行檢測，具有靈敏度高，價格低廉的特點，是目前檢測腫瘤隱匿微轉移最有效的方法。但是這種方法的缺點在于檢測過程中需要破壞CTCs，并且取樣過程中很容易污染，造成檢測結果呈假陽性，因而限制了這項技術的發展[15]。③流式細胞技術(flow cytometry，FCM)：CTCs是依靠攜帶熒光物質的抗體和腫瘤細胞特異標志物結合，使得腫瘤細胞“染色”，然后再用流式細胞儀進行鑒定分析。這項技術是一種在功能水平上對CTCs進行定量分析和分選的檢測手段。他可以高速分析上萬個細胞，同時從一個細胞中測得多個物理、化學參數。對細胞進行分析的同時還可以對細胞進行分選。盡管FCM 檢測方法相對簡便，具有速度快、精度高、準確性好等優點，但FCM 檢測方法因在形態學方面存在先天不足，因而在細胞形態學上確認腫瘤細胞，仍然有必要采用鏡下特異性免疫組織化學染色[16]。④免疫熒光法(immunofluorescence，IF)：是將通過熒光標記的特異性抗體在CTC原位進行抗原抗體反應，再使用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。這項技術依靠表達于多數上皮源性惡性腫瘤細胞表面的抗上皮細胞黏附因子(EpCAM)抗體進行免疫磁珠吸附來捕獲CTCs，并用4，62-二脒基-222-苯基吲哚(DAPI)染色(說明捕獲到的細胞為有核細胞)進一步確定捕獲細胞的特征，并用抗細胞角蛋白(CK)抗體(說明捕獲到的細胞為上皮細胞)及抗CD45抗體(說明捕獲到的細胞非白細胞)進行免疫熒光分析。這些研究證實了CTCs計數在常見實體惡性腫瘤中的臨床意義。目前國際上最常用的CellSearch CTCs檢測系統便是使用免疫熒光法，這項免疫磁珠捕獲EpCAM陽性細胞的技術，已被證實在乳腺癌、前列腺癌及大腸癌具有明確的預后預測價值[17]。但是，這項技術在肺癌領域的敏感性較低，通過CellSearch系統檢測101例原發性肺癌患者的CTCs，發現在7.5 ml外周血中，只有32%的IV期肺癌患者外周血能見到CTCs，IIIa期患者的檢出率為0[18]。這主要是因為CellSearch系統主要通過上皮表型EpCAM來識別CTCs。而肺癌CTCs在遷移入血的過程中通常會發生EMT，從而丟失了上皮細胞特征。因此，以上皮表型EpCA M 來檢測肺癌CTCs的方法，可能會產生假陰性的結果[14]。⑤循環腫瘤細胞芯片技術(CTC-Chip)：第一代的CTCs芯片是一種基于微流體學的CTCs檢測技術。它在一張與標準載玻片尺寸相同的硅片上面覆蓋 8 萬個顯微位點，每一個位點都包被上能夠捕獲CTCs的抗體。當血液樣品通過微流芯片時，這些位點確保CTCs在流過芯片前捕獲它們。第二代 HB 芯片將微芯片安裝在標準載玻片上，利用標準的，病理檢測方法對癌細胞進行鑒別，在增加血液樣本處理量的，同時，提高了捕獲罕見CTCs的能力。HB 芯片從幾例患者的血液樣本中捕捉出4～12 個CTCs群，而過去捕捉的CTCs中從未發現此類的腫瘤細胞群。這項新技術對腫瘤轉移進行更精密的研究以及進一步地開展靶向性癌癥治療的臨床研究提供了一個有力的平臺[19]。

3 小結

外周血中CTCs的檢測及評估有助于腫瘤的早期診斷，判斷預后，評估抗腫瘤藥物的療效及制定個體化治療方案，是一種具有高度可行性和可重復性的非侵入性新型診斷工具。一般來說，保證特異性前提下的高敏感度、便于臨床應用、可重復性好是CTCs檢測技術的三個重要評判標準。CTCs的富集技術已經日趨成熟，通過高效的富集方法，能否通過病理學手段對循環中的腫瘤細胞進行病理學判定，有助于我們對患者進行真正的無創“液態活檢”[20]。但目前CTCs檢測的臨床應用仍然存在諸多亟待解決的問題。在未來的研究中，單純CTCs的計數是不夠的，通過CTCs基因表達確定特定亞型可能更為重要。腫瘤患者形成轉移可能性，在通過分子生物學技術對CTCs的提取、分離及分析中得到與之相關的信息。未來，“抗CTCs”的治療目標將是一個富有成果的戰略，其從根本上防止轉移灶形成，并對復發或者接受根治性治療的患者進行有針對性的個體化治療。CTCs的相關研究中，在不同種類的腫瘤疾病中，有來自不同技術方的明確證據顯示外周血中CTCs的數量及預后之間存在相關，對于早期和晚期腫瘤患者的預后均有相關。同樣，腫瘤輔助治療過程中CTCs 似乎可以作為療效的指標。這是否可取代現有臨床腫瘤檢測“金標準”CT-斷層影像圖像仍待觀察，但這是令人振奮的前景。CTCs的檢測，是非侵入性的活檢，在NSCLC的研究中我們可以將CTCs與已知的EGFR突變檢測相互結合，對收集到的CTCs直接進行基因分析，反映原發腫瘤的情況。對于CTCs的研究，未來廣泛實現使用非侵入性的基因檢測并指導靶向藥物治療，也可能成為臨床肺癌診治的必要手段。

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Advances in the detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer

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