循環腫瘤DNA檢測及相關研究進展

張孝歡，周 玉

(1.西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072)

循環腫瘤DNA檢測及相關研究進展

張孝歡1，2，周 玉2

(1.西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072)

組織活檢是目前癌癥診斷的金標準，也是腫瘤基因分型的一種方法，但由于腫瘤的異質性和疾病的進展，組織活檢對腫瘤的進展、預后、治療和基因分型的監測有一定的局限性，因此需要一種更優化的檢測方法。基于血漿循環腫瘤DNA(Circulating Tumor DNA，ctDNA)的液體活檢對基因突變的篩查具有高敏感性和特異性，可持續動態觀測腫瘤的進展。利用ctDNA的檢測能準確檢測腫瘤的基因突變，有利于腫瘤的早期發現，還能準確判斷腫瘤的進展、預后及協助靶向治療。

ctDNA；腫瘤；生物標志物；檢測方法

1 概述

1.1 循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 的發展史 1948年科學家們首次發現人體血液中存在著循環游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)，1997年，研究發現癌癥患者的循環游離DNA明顯高于正常患者[1]。17年后，人們才發現這些DNA來自腫瘤，并含有腫瘤的標志性突變。最開始，循環DNA的實際應用并不在癌癥領域，而是在產前診斷。Lo等[2]推測胎兒DNA能夠進入血液，并于1997年向人們成功展示，孕婦血液中攜帶著男性胎兒的Y染色體。這讓無創產前診斷成為可能，是產前診斷的一次革命。癌癥研究晚于產前診斷，這是因為腫瘤DNA比胎兒DNA更難檢測，而且早期的測序技術還不夠準確可靠。近10年，隨著第二代測序技術(Next-Generation Sequencing，NGS)的到來，大大提高了ctDNA檢測靈敏度和特異性，使得ctDNA檢測在臨床研究及應用中起到重要的作用[3，4]。同時ctDNA 可以做為動態監測腫瘤的有效工具，目前有關ctDNA在乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤中對于腫瘤輔助診斷和預后監測的相關科研成果已被相繼報道[5～8]。

1.2 ctDNA的生物學特點 ctDNA是存在于血漿或血清中的單或雙鏈DNA。早期研究表明 ctDNA具有許多癌癥相關的分子特性，如單核苷酸突變、甲基化改變和病毒基因整合入原癌基因激活的腫瘤突變，因此有研究者推測其來源于腫瘤組織。近年來，ctDNA已經逐漸應用到臨床領域，但其許多生物學特性仍不清楚。例如，ctDNA片段的大小仍然是不確定的：有些人認為它比cfDNA長[ 9]。但另外一些人持相反態度[10]，Jiang等發現肝癌患者的血漿中都存在極長或極短的核酸分子，短的片段易檢測出腫瘤相關拷貝數畸變[11]；Madhavan等報道了乳腺癌患者也存在類似的現象[12]。

ctDNA的來源目前研究報道有三種：①細胞凋亡或壞死的腫瘤細胞；②活的腫瘤細胞；③循環腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)。有研究表明，cfDNA片段大小約166 bp，類似于那些典型的凋亡細胞釋放的cfDNA的長度[13]。在凋亡細胞中的蛋白水解活性異常可以導致 DNA和核小體釋放進入血液循環。Roth等發現，在凋亡細胞中相關的蛋白水解活性伴隨血液中脫氧核糖核酸水平的升高而發生相應變化[14]。在腫瘤進展過程中，凋亡的腫瘤細胞的蛋白水解酶活性變化使DNA和核小體進入血液[15]。以上這些研究都支持ctDNA可能來自凋亡或壞死的腫瘤細胞。然而，早期癌癥患者血漿中也含有ctDNA，因此凋亡或壞死的腫瘤細胞可能不是它唯一的來源。體外研究發現腫瘤細胞可以連續自動地釋放脫氧核糖核酸，早期乳腺癌患者可檢測到ctDNA，并且ctDNA的數量增加與腫瘤生長相關，進一步支持ctDNA可能來源于活體腫瘤細胞。有研究證明ctDNA和CTC包含相同的基因突變，而血液既包含CTC又包含ctDNA，這說明CTC可能是ctDNA另一個來源。

ctDNA對腫瘤的轉移起到重要的作用。1999年Garciía-Olmo等表明從荷瘤鼠得到的血漿可以穩定地改變體外培養的正常細胞，并首次提出了假設：“genometastasis”，轉移灶內占主導地位的癌基因來自原發腫瘤，推測其由于易感細胞的轉移，到達遠處的目標器官，并在血漿中循環[16]。ctDNA在腫瘤的轉移中通過攝取凋亡小體或virtosomes在腫瘤細胞與正常細胞間水平移動，導致遠處轉移。這些數據表明ctDNA與腫瘤的遠處轉移有密切關系。已有研究報道，ctDNA與腫瘤的脈管侵襲有相關性，當腫瘤患者血管侵襲時血漿中ctDNA具有顯著更高的檢出率[17]。

2 技術與應用

2.1 ctDNA的分離提取技術 ctDNA在血液中的含量極少，片段很小，提取難度大。目前提取cfDNA最常用的方法主要有傳統的酚-氯仿-異戊醇法，磁珠法(SIGMA)、硅膠膜吸附柱法(QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen)等。但每種方法都存在它的優缺點。

傳統的cfDNA的提取方法是酚-氯仿-異戊醇法，后來在傳統的酚-氯仿-異戊醇法的基礎上加以改進，在DNA沉淀步驟中配合使用DNA助沉劑，以期使得經過酚-氯仿去除蛋白等污染的DNA分子盡可能多的析出并沉淀。酚-氯仿-異戊醇配合微量DNA助沉劑法比傳統的酚-氯仿-異戊醇法可以獲得更高的DNA含量及純度，但是兩種方法的DNA純度未達到1.8～2.0這一理想區間，提示所提取DNA中可能含有蛋白或多糖污染。

磁珠法的主要材料是一種表面包裹有介孔二氧化硅的磁性復合微粒——介孔納米磁珠，其特點為具有較大的表面積和較強磁分離能力，且制備工藝過程簡單，成本相對較低，尤其適合于痕量DNA樣品的提取。但這種方法純度相對較低，這可能是由于磁珠的吸附能力的限制。介孔納米磁珠理論吸附能力為每1 μl磁珠可吸附10 ng DNA分子，適用于DNA含量極少的樣品。

QIAamp試劑盒是目前較公認的cfDNA提取試劑盒。各實驗室的提取濃度略有不同。然而所提取cfDNA的純度值則鮮有報道。楊波應用QIAamp試劑盒提取90例cfDNA測得OD260/OD280介于1.24～1.76，亦未達到1.8～2.0這一理想區間，由此推斷，由于cfDNA提取難度較大，即使使用國際公認的試劑盒，同樣會存在一定的蛋白或多糖污染，影響其純度值。但qPCR結果表明，雖然所提取的DNA純度未達到1.8～2.0這一理想區間，但是仍可有效進行擴增，擴增成功率為100%。

2.2 ctDNA的檢測技術 由于ctDNA的量少且片段小，對它的檢測造成了很大的阻礙。ctDNA檢測技術可分為兩個階段。第一階段為基于PCR技術的檢測技術，如直接測序法(Sanger法)、突變擴增阻滯系統(amplification refractory mutation system，ARMS)法、微滴數字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)、BEAMing數字PCR法、COBAS法等。第二階段為在NGS基礎上發展起來的檢測方法。

直接測序法：Sanger法是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X射線膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

ARMS法是利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計等位基因特異性 PCR擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時才能出現PCR擴增帶，從而檢測出突變。ARMS方法檢測靈敏度明顯高于直接測序法等其他方法，可檢測出樣品中含量低至0.1%～1.0%的突變基因；該方法結合實時PCR平臺實現擴增時閉管操作，操作簡單，無需產物的后處理，能最大程度地避免擴增產物的污染。現已成為國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進的技術之一，其在臨床應用中的優勢已被業內專家廣泛認可。

數字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作為DNA定量的新技術，是將一個標準的PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子(DNA模板)，實現“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數目“數出”目標序列的拷貝數。這種方法的優點是可以對ctDNA進行絕對定量，靈敏度可達到單個核酸分子，檢測限低至0.001%，但同時也存在只能檢測已知的突變位點、通量低的缺點。

BEAMing技術是結合數字PCR與流式技術，利用特異性PCR引物擴增目標突變區，與磁珠(磁珠上固定有特異的PCR引物)混合進行油包水單分子擴增反應。反乳化作用后，利用不同顏色的熒光探針結合磁珠上的PCR產物，發出紅色或綠色熒光，使用流式細胞儀分析磁珠顏色來確定突變情況。這種方法實現了單分子DNA絕對定量，其劣勢是成本高、操作復雜，而且成功率不算太高，因此目前應用并不廣泛。

現在對ctDNA的檢測方法沒有統一的標準，大家都在探索中。Thress等通過檢測38例肺癌患者的EGFR敏感突變以及T790M耐藥突變，對比分析了4種檢測方法(ARMS法、COBAS法、微滴數字PCR法以及BEAMing 數字PCR 法)在組織和血漿ctDNA中的敏感性和特異性。對于EGFR敏感突變，COBAS法、微滴數字PCR法以及BEAMing數字PCR 法敏感性略高(86%～100%)，但三者之間差異不明顯；然而，對于T790M 突變，微滴數字PCR法和BEAMing數字PCR法具有更高的敏感性(69%～71%)，明顯高于ARMS法(29%)和COBAS 法(41%)；以上結果提示數字化PCR平臺具有更好的敏感性。但是，伴隨檢測敏感性的提高，特異性卻下降，微滴數字PCR法和BEAMing法檢測EGFR敏感突變的特異性僅為83%和67%，明顯低于ARMS 法和COBAS 法(二者均為100%)，因此尋找二者之間的平衡點顯得尤為重要。雖然這些基于PCR的方法具有較好的臨床可應用性，但主要針對單個或幾個基因已知的突變檢測。

隨著研究的深入，僅檢測幾個基因變異是不夠的，需要建立多基因檢測平臺，NGS為此提供了機會。NGS 技術的檢測限為0.2%～1%，可以在保證敏感性的基礎上檢測盡可能多的基因變異。在NGS的基礎上發展了很多新技術，其中尤為典型的是Newman等開發的一種稱為癌癥個性化分析深度測序(cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-seq)對ctDNA進行量化。該方法利用定制化的NimbleGen SeqCap EZ Choice Library作為”篩選器”(包含了139個相關基因的521個外顯子和13個內含子，共約125 kb)對樣本進行靶向捕獲后再進行深度測序，也就是用新一代測序儀預選特異性超過97%的預擴增區域進行有針對性的深度測序[15]。CAPP-seq對非小細胞肺癌(NSCLC)的ctDNA檢測結果靈敏度高、特異性強且經濟可行。用CAPP-seq發現在I期和II～IV期非小細胞肺癌患者中，ctDNA的檢出率分別為50%和100%。Couraud等[18]利用NGS技術同時分析了107個血漿標本的多個基因(包括EGFR、ERBB2、K-Ras、BRAF 以及PIK3CA)，與組織標本相比，檢測的敏感性為58%(43% ～71%)，特異性為87%(62%～96%)。近期Lebofsky等[19]利用NGS技術檢測了27例不同瘤種患者ctDNA 中的46 個基因，涵蓋6800個COSMIC熱點突變，結果顯示，轉移灶組織活檢出的29 個突變有28 個可以在ctDNA 中檢測到。這些結果證明NGS 技術用于ctDNA 多基因突變檢測的可行性。

NGS 技術不僅可以用于檢測已知基因變異，更重要的是可以進行全基因組范圍內的基因變異分析，包括基因突變、重排以及基因組拷貝數變異(copy number variation，CNV)，并可以發現未知的基因變異。然而，這些新技術還是有它的的局限性。首先，NGS相關的檢測方法能檢出約50%的早期患者，因此敏感性要求進一步提高。此外，成本保持相對較高，限制了其臨床應用。幸運的是，第三代測序技術，高通量，測序成本逐漸降低使ctDNA的檢測更有希望廣泛應用于臨床領域[20、21]。

2.3 ctDNA的臨床應用

2.3.1 通過腫瘤基因分型來實現精準治療 基因分型可以分析遺傳突變，在癌癥治療過程中具有重要的作用[22，23]。傳統的組織活檢只能獲得局部和靜態的腫瘤信息，無法實時反映由于腫瘤異質性和持續進展中不同階段的基因分型[24]。Dawson等[25]在30例具有點突變或結構變異的晚期乳腺癌患者的治療過程中動態獲取ctDNA進行了深度測序，發現動態監測同一腫瘤患者不同階段的ctDNA基因突變，根據不同的基因分型針對性地進行靶向治療和藥物療效監控，可以起到更好的治療效果[26]。因此，基于ctDNA分析的液體活檢可以提高對腫瘤基因分型的分析和靶向治療水平，對患者制定個性化醫療方案有重要作用，并在精準醫學的推動上發揮重要的作用。

2.3.2 疾病監測與治療評價 多數惡性腫瘤在治療過程中進展快且易復發。疾病監測與治療評價對臨床醫生確定后續治療方案是很重要的。Bettegowda等已經表明，連續ctDNA 檢測可用于評價治療效果、評估緩解狀態和檢測復發與進展[27]。ctDNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期癌癥患者的檢出率分別為47%，55%、69%及82%，這表明ctDNA水平增加與癌癥進展相關。此外，Diehl等發現大多數患者在手術后ctDNA水平有明顯的減少或缺如。在本研究中術后檢測到ctDNA的患者都復發，而那些沒有檢測到ctDNA的患者得到緩解[ 3]。Reinert等發現利用ctDNA檢測方法比利用常規檢測方法隨訪患者術后腫瘤復發早十個月[28]。這些研究表明ctDNA檢測可以快速預測治療結果，并為臨床醫生確定下一個治療方案提供重要參考。

2.3.3 循環腫瘤DNA與耐藥的機制 耐藥性是癌癥治療失敗的主要原因。然而到目前為止，對腫瘤耐藥研究的適當方法還沒有建立[ 29]。ctDNA檢測的低創性和簡便等優點為動態監測腫瘤的耐藥機制提供了一個可行的方法。Diaz等分析接受EGFR抑制劑治療的肺癌患者的ctDNA，發現了42個KRAS基因突變。進一步的研究表明，這種方法可比常規方法早5個月檢測出與腫瘤進展和耐藥相關的標志[ 30，31 ]。肺癌患者接受一二代EGFR抑制劑治療發生耐藥后，我們可以通過血液中的ctDNA來檢測不同時期的耐藥突變，選擇靶向藥物。例如，對于非小細胞肺癌患者，AZD9291在發生T790M耐藥突變時有很好的抗腫瘤抗性；crizotinib在發生METexon14剪接點突變時有較好的效果。因此，通過ctDNA的液體活檢實時監測耐藥突變選擇靶向藥物可以更好地指導個性化用藥，減少副作用，減少患者經濟負擔。

2.3.4 ctDNA檢測開啟腫瘤預防新時代 目前，基于ctDNA的液體活檢是腫瘤早篩和復發檢測的新手段，可以根據ctDNA的檢測結果為腫瘤的預防提供指導。這是因為癌癥漫長的發病過程為預防提供了充足的時間，加上分子癌變的發生是在癌癥啟動最早階段，而不是組織學的結果，所以可以把癌癥的預防線從原來癌癥早期階段推前到細胞癌變的階段，這是傳統的腫瘤標志物和影像學檢測都難以達到的。Diehl等通過研究發現術后和癌癥早期檢測出ctDNA的人是癌癥的高危人群，我們可以根據檢查結果對患者采取預防措施[3，32]。因此，分子技術的發展特別是腫瘤分子技術的發展，開啟了腫瘤預防的新時代。

2.4 ctDNA的挑戰 ①檢測方法不統一，缺少標準化流程。從基于PCR的技術到NGS 技術，除了ARMS 法，其他檢測方法并未形成標準化的流程。另外，各中心在樣本處理以及病例選擇、數據分析方面的差異導致結果的重復性欠佳。因此，我們需要進一步標化檢測方法，盡可能減少人為因素帶來的偏倚。②雖然ctDNA 基因檢測的特異性較好，但敏感性卻不理想，如果提高敏感性，又可能導致特異性的下降。因此，選擇合適的檢測方法找到敏感性和特異性之間的平衡點是解決的辦法。③利用ctDNA進行NGS的全基因組測序可以進行多基因甚至基因組分析，還可以發現未知的基因變異。但這要求更大量的ctDNA輸入量，但勢必同時帶來更多正常cfDNA的干擾。因此，需要進一步研究如何提高ctDNA純度。④由于腫瘤異質性的存在，局部組織穿刺標本很難用于基因變異的定量分析，但外周血中的ct-DNA可能反映腫瘤DNA整體水平，因此可以用于基因變異的定量分析。目前用于定量分析的方法很多，但同樣是缺乏標準化的流程、缺乏統一的與臨床相關的定量數據，缺乏各定量方法間優缺點的比較，因此，基于ct-DNA的定量研究尚處于起步階段。

總而言之，ctDNA的檢測無論展現患者對手術的應答情況、早期風險預測、實時追蹤腫瘤進展，還是在腫瘤耐藥突變檢測，為其尋找有效的癌癥療法或者藥物組合等方面都體現了ctDNA的在臨床應用的巨大前景。《ASCO年度報告：2015臨床腫瘤學進展》中，液體活檢技術被列為腫瘤治療領域下一個十年趨勢之一。ctDNA作為液體活檢的首選已逐漸從科研走向臨床。而歐盟批準將ctDNA檢測用于吉非替尼的伴隨診斷則更是標志著ctDNA臨床應用的大規模實現[33]，在此觀點上包括美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)、歐洲臨床腫瘤學會(ESMO)及中國肺癌EGFR基因突變檢測專家共識等指南均達到一致意見。但在ctDNA的檢測到臨床應用仍是一條布滿荊棘卻充滿希望的路，需要我們不懈努力。

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Detection and related advancs in the study of Circulating Tumor DNA

ZHANG Xiao-huan12，ZHOU Yu2

國家自然科學基金資助項目(編號：81400437)

R73-3

B

1672-6170(2017)01-0148-05

2016-01-09；

2016-06-24)