玉米WRKY轉錄因子非生物脅迫的表達分析

決登偉，桑雪蓮，舒 波，劉麗琴，王一承，石勝友

（中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所/農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091）

玉米WRKY轉錄因子非生物脅迫的表達分析

決登偉，桑雪蓮，舒 波，劉麗琴，王一承，石勝友

（中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所/農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091）

WRKY蛋白是一類植物特異的轉錄因子家族，在植物響應病害及非生物脅迫中起重要作用。通過生物信息學方法，從玉米基因組中得到3個WRKY家族基因序列（ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like、ZmWRKY62-like），預測表明3個蛋白都定位于細胞核。熒光定量PCR分析表明，3個基因在玉米的不同器官中都有表達，但具有組織表達特異性。ZmWRKY14-like和ZmWRKY62-like在幼果中的表達量均顯著高于在其他組織中的表達量，ZmWRKY25-like基因在葉、穗絲和幼果中的表達量高于在其他組織中的表達量。鹽脅迫下，ZmWRKY25-like基因呈上調表達，ZmWRKY62-like基因呈下調表達；干旱脅迫下，ZmWRKY62-like基因出現下調表達；低溫脅迫下，ZmWRKY25-like基因呈上調表達。結果表明，ZmWRKY25-like可能參與了植物對鹽和低溫脅迫的響應，ZmWRKY62-like基因則可能參與了植物對鹽和干旱脅迫的響應。

玉米；WRKY轉錄因子；干旱；鹽脅迫；低溫

WRKY是植物體中最大的轉錄因子之一，廣泛分布于植物中，與其他轉錄因子一樣，WRKY蛋白通過特異性結合啟動子區域的W-Box來調控基因表達［1］。1994年，第1個WRKY轉錄因子（SPF1）從甘薯中被鑒定出來［2］，隨后陸續在眾多植物中發現，且其數目從低等植物到高等植物呈現上升趨勢。例如，油菜 （Brassica napus L.）中有46個WRKY轉錄因子成員［3］，黃瓜（Cucumis sativus）中有57個［4］，麻風樹（Jatropha curcas）中有58個［5］，蓖麻（Ricinus communis L.）中有58個［6］，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有72個［7］，白梨（Pyrus bretschneideri）中有103個［8］，白楊（Populus trichocarpa）有105個［9］，谷子（Setaria italica）有105個［10］，水稻（Oryza sativa）中有109個［11］，棉花（Gossypium）中有109～112個［12］，玉米（Zea may L.）中有136個［13］，大豆（Glycine max）中有197個［14］。

WRKY蛋白都包含1個或者兩個WRKY結構域，包括N-端高度保守的WRKYGQK七肽及C-端的鋅指結構（Cx4-7Cx22-23HxH/ C）。根據WRKY結構域的數目及鋅指結構的特點可將WRKY蛋白劃分為3個主要類型。第Ⅰ類有兩個WRKY結構域，鋅指結構類型為C2H2，第Ⅱ、Ⅲ類只含有1個WRKY結構域。其中，第Ⅲ類成員的鋅指結構類型為C2HC，而第Ⅱ類為C2H2。根據進化關系及WRKY結構域中某些氨基酸基序不同，第Ⅱ類WRKY轉錄因子又可細分為5個小類（a～e）［15］。

WRKY轉錄因子參與植物多種生理生化過程，如應對生物和非生物脅迫，參與葉片衰老、發育和次生代謝等［16］。植物在受到外界傷害后，通過SA和JA等防衛反應信號途徑激活植物防衛基因的表達，從而對逆境脅迫產生抗性反應。大量證據表明，SA和JA分別介導活體營養型病原菌和死體型病原菌兩條不同的防衛應答信號途徑，多數情況下這兩種信號途徑是相互拮抗的，有時也存在協同作用，有些WRKY蛋白處于兩種信號途徑的調節交叉點上，如AtWRKY70既可以激活SA介導的抗病信號途徑，同時也能抑制JA介導的信號途徑，從而實現對擬南芥抗病反應的調控［17］。同樣，WRKY家族基因在響應植物非生物脅迫中也發揮重要作用。在擬南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33呈現鹽促進表達，且異源表達這兩個基因增強了植物對NaCl的耐性［18-19］。在水稻中，過表達OsWRKY45促進擬南芥對干旱的耐性，OsWRKY8異源表達促進擬南芥對滲透的耐性，OsWRKY72的異源表達則會影響根的生長和逆境耐性［20］。另外，OsWRKY89的過表達促進植株對紫外線的抵御［21］，過表達OsWRKY11增強了轉基因植株對高溫的耐性［19］。在白梨的103 WRKY基因中，44個PbWRKY在干旱處理下呈上調表達［8］。高粱（Panicum miliaceum L.）中，10個PmWRKY基因的表達受到干旱脅迫誘導，16個PmWRKY基因的表達受到低溫脅迫誘導［22］。

玉米是當今世界重要的糧食作物之一，亦是重要的飼料和工業原料作物，在世界糧食總產量中居首位［23］。中國作為世界第二大玉米生產國，近30多年來玉米生產發展非常迅速，總產量也呈逐年上升趨勢。世界糧農組織統計數據庫（FAOSTAT）顯示，2012 年玉米產量超過稻谷產量，成為中國第一大糧食作物［24］。2013年，中國玉米常年種植面積達3 510 萬hm2，總產量約2.17 億t，占糧食總產量的1/3。但在實際生產中，玉米常常會因受到諸多不利環境因素的影響而大面積減產，如干旱、鹽脅迫和低溫等。目前，已有研究表明玉米基因組中有136個WRKY家族基因，但還鮮有玉米WRKY基因在植物響應非生物脅迫中作用的相關報道。本研究中，我們利用生物信息學技術從玉米的基因組發現3個WRKY家族基因，ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like、ZmWRKY62-like都含有WRKY轉錄因子典型的WRKY結構域及鋅指結構。利用熒光定量PCR方法，進一步對3個基因在玉米不同組織、干旱、鹽脅迫及低溫脅迫的表達進行分析，以期了解該基因在植物生長發育和不同逆境下的作用，為挖掘玉米抗逆基因和豐富E2蛋白在不同作物中的功能研究提供一定的理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為玉米自交系B73，玉米組織根、莖、葉、穗、幼果和穗絲取自大田種植的玉米植株，采樣時期為乳熟期。供試植物RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物公司，反轉錄試劑及Realtime PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司，引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，其他試劑購自上海生物工程有限公司。Realtime PCR反應儀器為Roche的LightCycler480。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 逆境處理所用材料為B73種子萌發的幼苗，種子萌發后，轉入1/2 Hoagland培養液，在培養箱中繼續培養，生長條件為28（±2）℃、14 h光照、10 h黑暗。3周后，選擇長勢均一的幼苗進行后續模擬脅迫處理試驗。每個處理具體如下：（1）鹽脅迫處理，將幼苗放入含200 mmol/L NaCl的1/2 Hoagland培養液中培養，按0、1、6、24 h時間點取樣；（2）干旱脅迫處理，將幼苗放入含20% PEG6000的1/2 Hoagland培養液中培養，按0、1、6、24 h時間點取樣；（3）低溫脅迫處理，將幼苗放入溫度設置為4℃的培養箱中培養，按0、1、6、24 h時間點取樣。試驗設3次重復，取樣部位為葉片。所有取樣剪成2 cm左右的小段，立即放入液氮速凍并轉入-80℃冰箱中保存、備用。

1.2.2 ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like序列分析 ZmWRKY14-like、

ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like 3個基因序列從PLAZA 3.0 （http：//bioinformatics.psb. ugent.be/plaza/versions/plaza/）數據庫中獲得，并在玉米基因組數據庫（MaizeGDB，http：//www. maizegdb.org/）中進行驗證。3個基因的ORF、氨基酸長度和染色體定位信息從PLAZA 3.0數據庫獲得。應用在線軟件SMART （http：//smart.emblheidelberg.de/）預測蛋白結構域，蛋白的等電點和分子量在ExPASy （http：//expasy. org/tools/）上進行分析，蛋白的亞細胞定位通過Plant-mPLoc （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgibin/ PlantmPLoc.cgi）在線預測，3個基因的外顯子內含子結構利用Gene Structure Display Server（GSDS）（http：//gsds.cbi.pku.edu. cn/）在線軟件分析。用Clustal X進行序列多重序列對比，同時利用MEGA 5軟件進行氨基酸序列同源性分析及系統發育分析，構建Neighbor-Joining進化樹，1 000次重復，其他均為默認設置。

1.2.3 植物總RNA提取及Realtime PCR分析 用植物RNA提取試劑盒提取不同材料的葉片RNA，然后用TAKARA公司的PrimeScript RT試劑盒反轉錄cDNA后作為模板，具體操作步驟參照說明書。根據已知玉米基因組中ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like 3個基因的CDS序列設計Realtime PCR引物，并以玉米的actin基因為內參基因，具體引物序列見表1。

PCR反應體系為20 mL，其中模板2 μL，上、下游引物各1 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，H2O 6 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃ 10 s、58℃ 20 s、72℃ 30 s，40 個循環后作熔解曲線（95℃→ 65℃，0.1℃/s）。在分析基因的表達時，上調或者下調大于2倍時認為存在差異，所有試驗3次重復。

表1 ZmWRKY基因定量PCR所用引物序列

2 結果與分析

2.1 ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like 3個基因生物信息學分析

以WRKY轉錄因子保守區氨基酸序列在PLAZA 3.0和MaizeGDB進行BLASTP搜索，獲得3個在進化關系上很接近的玉米WRKY轉錄因子家族基因，根據PLAZA 3.0數據庫對這3個基因的描述，分別將其命名為ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like。3個基因的信息見表2和圖1（封二）。其中，ZmWRKY14-like基因序列開放閱讀框為1 143 bp，編碼的蛋白具有380個氨基酸，其分子量為40.89 ku，理論等電點為6.67，位于玉米第Ⅰ染色體；ZmWRKY25-like基因序列開放閱讀框為921 bp，編碼的蛋白具有306個氨基酸，其分子量為31.91 ku，理論等電點為9.74，位于玉米第Ⅳ染色體；ZmWRKY62-like基因序列開放閱讀框為801 bp，編碼的蛋白具有266個氨基酸，其分子量為28.96 ku，理論等電點為6.54，位于玉米第Ⅶ染色體。預測表明3個基因都定位于細胞核。對3個基因的氨基酸序列進行分析發現，ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like都含有1個WRKY結構域，鋅指結構同為C-X5-C-X23-H-X1-H型，根據WRKY轉錄因子分類原則，屬于第Ⅱ類WRKY轉錄因子。

表2 ZmWRKY基因信息

進一步分析ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like與其他植物WRKY蛋白間的親緣關系，發現ZmWRKY14-like與玉米的ZmWRKY14 （NP_001149833.1）、二穗短柄草的BdWRKY14 （XP_014752000.1）、短花藥野生稻的ObWRKY14 （XP_006650925.1），ZmWRKY25-like與玉米的ZmWRKY25 （NP_001151889.1）、小米的SiWRKY14 （XP_004972520.1）、短花藥野生稻的ObWRKY17 （XP_015691793.1），ZmWRKY62-like與小米的SiWRKY18-like（XP_004956832.1）分別聚到同一分支，即與禾本科植物的WRKY蛋白親緣較近，具有較高同源性（圖 2）。

2.2 玉米不同組織 ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like的表達分析

圖2 玉米WRKY轉錄因子與其他物種WRKY蛋白的進化關系分析

用Realtime PCR技術分析ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like 3個基因在玉米幼苗根、莖、葉、穗、幼果和穗絲中的表達情況。結果（圖3）顯示，3個基因在玉米不同組織中都檢測到表達，但存在差異表達情況。其中，ZmWRKY14-like和ZmWRKY62-like在幼果中的表達量均顯著高于在其他組織中的表達量，特別是ZmWRKY14-like在幼果中的表達量達到了穗絲中表達量的80倍。ZmWRKY25-like基因在葉、穗絲和幼果中的表達量高于在其他組織中的表達量，分別是在莖中表達量的36、48、25倍。

圖3 玉米WRKY基因的組織表達分析

2.3 不同非生物逆境脅迫下ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like的表達分析

用Realtime PCR技術分析ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like 3個基因在鹽、干旱和低溫處理下表達情況。如圖4～圖6所示，鹽脅迫下，ZmWRKY14-like基因在6 h時出現下調表達，為對照的0.48倍，在24 h時恢復到對照水平；ZmWRKY25-like基因的表達在1 h時為對照的2.4倍，6 h時恢復到本底水平，24 h時上調為對照的3.3倍； ZmWRKY62-like基因在處理時間內呈現下調表達趨勢，6 h和24 h時的表達量分別為對照的0.42、0.48倍。干旱脅迫下，ZmWRKY14-like基因的表達量在處理時間內未出現顯著變化；ZmWRKY25-like基因的表達量在處理1 h時上升為對照的2.6倍，但在6 h時下調為對照的0.1倍，24 h時恢復對照水平；ZmWRKY62-like基因在6、24 h時出現下調表達，分別為對照的0.44、0.38倍。低溫脅迫下，ZmWRKY25-like基因的表達量在24 h時上升為對照的3.2倍。上述結果表明，ZmWRKY25-like可能參與了植物對鹽和低溫脅迫的響應，ZmWRKY62-like基因則可能參與了植物對鹽和干旱脅迫的響應。

圖4 玉米ZmWRKY14-like基因的逆境表達分析

圖5 玉米ZmWRKY25-like基因的逆境表達分析

圖6 玉米ZmWRKY62-like基因的逆境表達分析

3 結論與討論

WRKY是植物中一類重要的轉錄因子家族，也是植物轉錄因子中最大的家族之一［25］，在甘薯、水稻、擬南芥、棉花、大麥等植物中都有研究報道。在玉米基因組中有119個WRKY基因，編碼136 WRKY蛋白［13］。但目前鮮有關于單個玉米WRKY的功能研究報道，對其在玉米生長發育及脅迫響應中的具體作用還所知甚少。在本研究中，我們通過生物信息學方法從MaizeGDB數據庫中得到3個玉米WRKY家族基因：ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like。這3個基因都具有相似的WRKY保守結構域和鋅指結構，都屬于第Ⅱ類WRKY轉錄因子。

WRKY轉錄因子參與植物生長發育及形態構成，不同的WRKY基因的表達可能具有組織特異性。37個擬南芥WRKY基因中有12個在根的成熟區細胞特異表達，表明這些WRKY基因可能參與調控擬南芥根細胞的成熟［7］；在擬南芥中過表達OsWRKY72會減少側根數，而且比野生型顯著增加分支數［26］；過表達OsWRKY31抑制了水稻不定根的形成［27］；過表達OsWRKY89基因則導致早期階段性生長延遲，節間長度和細胞壁酚類化合物減少，莖部木質化著色增加［21］；AtWRKY6參與葉片衰老過程［28］；蓖麻的58個WRKY基因在不同組織中也呈現出差異表達模式，比如RcWRKY14只在雄花中有微量表達，RcWRKY21和RcWRKY27只在葉中表達［29］。在本研究中，ZmWRKY14-like、ZmWRKY25-like和ZmWRKY62-like基因在玉米不同組織中都檢測到表達，但表達存在差異。其中，ZmWRKY14-like和 ZmWRKY62-like基因在葉片中的表達量最低，ZmWRKY25-like基因在莖中的表達量最低。ZmWRKY14-like和ZmWRKY62-like在幼果中的表達量都顯著高于其他組織，特別是ZmWRKY14-like在幼果中的表達量達到了葉片中表達量的83倍。ZmWRKY25-like基因在葉、穗絲和幼果中的表達量高于在其他組織中的表達量。這種差異表達模式表明，3個基因可能參與了玉米不同組織器官的生長發育，特別是果實的發育。

WRKY轉錄因子在植物對非生物脅迫的響應中發揮了重要作用。主要的非生物脅迫有高溫、低溫、干旱、鹽脅迫等，它們不但影響細胞的離子和滲透平衡，還會損壞細胞代謝平衡，導致活性氧（ROS）的積累。在擬南芥中有近2 000個干旱響應基因，其中就包含編碼WRKY基因［30］。AtWRKY25和AtWRKY33受鹽脅迫的促進表達，而它們的異源表達增強了轉基因植株對NaCl耐性［31］。AtWRKY25、AtWRKY28、AtWRKY40和AtWRKY70受鹽害、冷害和高鹽脅迫的誘導［32］。遏藍菜TcWRKY53基因受鹽害、冷害和滲透脅迫的誘導［33］。與這些研究報道類似，本研究中3種非生物逆境脅迫下，ZmWRKY25-like基因對鹽和低溫處理出現響應，在處理24 h時表達量分別上升為對照的3.3、3.2倍。ZmWRKY62-like基因則在鹽和干旱處理下出現下調表達，在處理后24 h時分別下降為對照的0.48、0.38倍。ZmWRKY14-like基因的表達在3種脅迫處理下均出現顯著變化。上述結果表明，ZmWRKY25-like可能參與了植物對鹽和低溫脅迫的響應，ZmWRKY62-like基因則可能參與了植物對鹽和干旱脅迫的響應。

隨著對植物基因組研究的深入，對轉錄調節因子的研究成為現今植物基因功能研究的重點之一。本研究結果表明，ZmWRKY14-like和ZmWRKY62-like基因在果實中的表達量最高，說明這兩個基因可能在玉米果實發育過程中起到一定作用，而ZmWRKY25-like基因可能參與葉、穗絲和幼果的發育形成過程。另外，鹽、干旱和低溫脅迫試驗結果表明，ZmWRKY25-like可能參與了植物對鹽和低溫脅迫的響應，ZmWRKY62-like基因則可能參與了植物對鹽和干旱脅迫的響應。該研究對解析WRKY轉錄因子在玉米中的生物學功能及挖掘逆境應答基因具有一定意義。

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（責任編輯 崔建勛）

Expression analysis of maize WRKY transcription factor genes under abiotic stress

JUE Deng-wei，SANG Xue-lian，SHU Bo，LIU Li-qin，WANG Yi-cheng，SHI Sheng-you
（Institute of South Subtropical Corp Research，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/
Key Laboratory of Tropical Fruit Biology，Ministry of Agriculture，Zhanjiang 524091，China）

WRKY proteins are large family of plant-specific transcription factors （TFs），play essential roles in regulating plant responses to pathogens and abiotic stress. In this study，we identified three WRKY transcription factor （TF）genes （ZmWRKY14-like，ZmWRKY25-like，ZmWRKY62-like）in maize by using bioinformatics method. Plant-mPLoc predicted that these three proteins were all localized in nucleus. Real-time qPCR assay showed that ZmWRKY14-like，ZmWRKY25-like，ZmWRKY62-like expressed in all tested maize tissues，but had differential expression. The expression levels of ZmWRKY14-like and ZmWRKY62-like in young fruit were significantly higher than those in other tissues，while the expression level of ZmWRKY25-like gene in leaf，spike and young fruit was higher than that in other tissues. The expression levels of three genes under different abiotic stress were also analyzed by real-time qPCR. The expression of ZmWRKY25-like was up-regulated，while ZmWRKY62-like was down-regulated under salt stress. The expression of ZmWRKY62-like was down-regulated under drought stress. Under low temperature stress，the expression level of ZmWRKY25-like was up-regulated. These results indicated that ZmWRKY25-like may be involved into plant response to salt and low temperature stress，and ZmWRKY62-like may be involved into plant response to drought and salt stress.

maize；WRKY TFs；drought stress；salt stress；low temperature stress

S513.01；Q786

A

1004-874X（2017）01-0015-08

2016-10-26

海南省自然科學基金（20163111）；國家自然科學基金（31572087）

決登偉（1986-），男，博士，助理研究員，E-mail：juedengwei@126.com

石勝友（1970-），男，博士，研究員，E-mail：ssy7299@163.com

決登偉，桑雪蓮，舒波，等. 玉米WRKY轉錄因子非生物脅迫的表達分析［J］.廣東農業科學，2017，44（1）：15-22.