不對稱PCR擴增檢測土壤中的腸道病原菌

劉燕++孫學明++鄒曉琳

摘 要：主要研究內容為通過對最佳反應總體系、反應時間和反應溫度等條件進行探索，建立用不對稱PCR擴增技術檢測土壤中典型腸道病原菌的實驗條件。實驗主要目的是通過不對稱PCR擴增技術獲得大量的單鏈DNA，為用基因芯片方法檢測土壤中的典型腸道病原菌做準備。應用不對稱PCR擴增檢測技術對樣品進行熒光標記后，與寡核苷酸基因芯片進行雜交，可以提高雜交效率。

關鍵詞：不對稱PCR 土壤 典型病原菌

中圖分類號：X17 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2016）11（b）-0062-02

不對稱PCR是指反應體系中兩條濃度不一樣的引物，在PCR擴增的后期，當其中量少的一條引物被消耗完以后，另一條繼續以線性擴增的方式，產生大量的擴增產物單鏈 DNA。部隊稱PCR擴增檢測技術可以應用的范圍相對較為廣泛：如配合RT-PCR擴增技術研究真核DNA外顯子、制備單鏈探針、DNA序列分析等，在寡核苷酸基因芯片的檢測應用方面，不對稱PCR在標記單鏈樣品方面比常規PCR更有優勢，與寡核苷酸芯片雜交效率也較高。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

研磨過篩（20目），-80 °C保存備用。

1.2 主要試劑及試劑盒

主要試劑及試劑盒：引物、dNTP、50 bp DNA Ladder，100 bp DNA Ladder、Taq DNA聚合酶、瓊脂糖、FastDNASPIN Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。

1.3 主要儀器

凝膠成像系統（Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy），PTC-100 PCR儀（MJ Research，Waltham，MA，USA），Mini-BeadBeater-16TM核酸提取儀（Biospec products，USA），DYY-8B型電泳儀（北京市六一儀器廠）FastPrepTM FP120核酸提取儀（Bio 101，Carlsbad，USA），高速離心機（上海安亭）。

1.4 DNA提取

利用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒與Mini-BeadBeater-16TM核酸提取儀提取土壤DNA。主要過程參見FastDNASPIN Kit for Soil試劑盒。

1.5 引物合成

參照文獻[1-2]合成引物：UP1：GAAGTCATCATGACCGT

TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，P2r：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRT

CNGTCAT（R指的是A或者G，Y指的是C或者T，N代表任何堿基）。

1.6 PCR產物電泳檢測

0.5×TBE緩沖液，6×上樣緩沖溶液，1%（w/v）瓊脂糖凝膠，200 V恒壓，電泳25～35 min。

2 結果與分析

引物的濃度比up1∶up2r依次為：1∶1、5∶1、10∶1、25∶1、50∶1、75∶1和100∶1。從圖1可以看出：當引物濃度比為5∶1時產生的單鏈擴增產物條帶比較微弱，隨著下游引物的濃度（10∶1、25∶1和50∶1）進一步減小，有較多的單鏈DNA條帶產生。

以上述PCR擴增產物1～7為模板，進行新一輪的PCR擴增，以獲得更多的單鏈DNA擴增產物。從圖2中可以看出：泳道1～3無任何的雙鏈DNA條帶產生，泳道4有微弱的單鏈DNA擴增產物條帶產生，泳道5～6有大量的單鏈DNA條帶產生，泳道7擴增產物條帶則開始減弱直至消失。主要原因是不對稱PCR線性擴增階段是在前半程擴增所產生的雙鏈產物的基礎上進行的，雙鏈產物的量過少易導致最終生成的單鏈產物也較少[3]，且指數擴增階段太短。

3 結語

土壤中具有代表性的腸道病原菌用不對稱PCR擴增技術檢測的最佳反應條件經驗證為：總體系25 μL，其中10×PCR 緩沖液2.5 μL，25 mmol/L Mg2+1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，引物UP1∶UP2r為50∶1或75∶1，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O補足體系。最佳PCR反應參數為95 ℃，5 min（95 ℃，1 min；68.4℃，1 min；72℃，2 min）35輪循環，72 ℃，10 min。

參考文獻

[1]Gyllensten U B，Erlich H A.Nationl Instistutes of Health[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（20）：7652-7656.

[2]Tankouo-Sandjong B，A Sessitsh，E Liebana，et al.MLST-v，multilocus sequence typing based on virulence genes，for molecular typing of Salmonella enterica subsp.enterica serovars[J].Journal of Microbiological Methods，2007（69）：23-36.

[3]孔德明，蔣海燕，沈含煦，等.分子信標用于不對稱PCR檢測乙型肝炎病毒[J].分析測試學報，2005，24（2）：7-10.