G蛋白偶聯(lián)受體30和磷酸化AKT蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達及意義

呂健勇+胡永斌

【摘要】 目的：對筆者所在醫(yī)院接受治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者的生物樣本進行實驗室研究，分析G蛋白偶聯(lián)受體30（GPR30）和磷酸化AKT蛋白（P-AKT）在腫瘤組織中表達的意義，并進行二者之間相關(guān)性分析。方法：選取2011年-2012年來筆者所在醫(yī)院接受治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者180例的活體組織樣本和50例正常子宮組織制成蠟塊切片，采用EnViSion免疫組化法和FISH法對每個標本中的GPR30和P-AKT進行其相關(guān)的基因陽性表達水平進行檢測，觀察免疫組化評分與FISH檢測G蛋白偶聯(lián)受體30和磷酸化AKT蛋白的高表達與基因擴增之間的重疊率，統(tǒng)計二者在不同的腫瘤組織中表達率，影響二者的表達因素及二者相關(guān)性探究。結(jié)果：GPR30和P-AKT的免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達與FISH檢測結(jié)果重疊率分別為74.5%、56.6%，差異顯著（P<0.05）；GPR30和P-AKT在正常子宮內(nèi)膜中陽性表達率均明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌內(nèi)陽性表達率，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；GPR30和P-AKT的表達與患者的年齡、組織分化程度、是否出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移及基層浸潤深度有關(guān)（P<0.05）；GPR30和P-AKT之間存在明顯的相關(guān)性，且相關(guān)性較好（字2=14.08，P<0.05，Φ=0.2693）。結(jié)論：FISH法與EnViSion免疫組化法檢測GPR30和P-AKT重疊率較好，GPR30和P-AKT與子宮內(nèi)膜腺癌之間可能存在因果聯(lián)系，且CPR30和P-AKT之間能夠相互影響，在臨床治療過程中可根據(jù)GPR30和P-AKT判斷組織分化程度和基層浸潤深度，在明確診斷上有一定的意義。

【關(guān)鍵詞】 G蛋白； 偶聯(lián)受體； AKT蛋白； 宮內(nèi)膜腺癌； 表達及意義

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.7.022 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）07-0044-03

子宮內(nèi)膜癌屬于發(fā)生于子宮內(nèi)的上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化，使得子宮上皮細胞的凋亡機制被抑制，從而使得部分異常子宮內(nèi)膜細胞無限增殖，進而由于壓迫和占位性病變而危及患者生命安全[1-2]。一般絕經(jīng)期前后女性發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的概率較高，也是女性生殖系統(tǒng)的三大癌癥同程度的陰道排液、陣發(fā)性腹部疼痛及相關(guān)身體征象。目前臨床上的治療方法主要有外科手術(shù)、放化療、激素治療及中醫(yī)治療。G蛋白偶聯(lián)受體30屬雌激素受體，與雌激素結(jié)合后釋放AKT相關(guān)因子，使得AKT系統(tǒng)被激活。相關(guān)研究指出，AKT系統(tǒng)是促進癌細胞生長的主要系統(tǒng)[3-4]。目前臨床上關(guān)于AKT信號系統(tǒng)的研究處于白熱化階段，而對與AKT與P-AKT之間的關(guān)系描述較少，而且對于GPR30與P-AKT之間關(guān)系的研究較少。因此，本文旨在通過對近1年來筆者所在醫(yī)院接受治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者的生物樣本進行實驗室研究分析GPR30和P-AKT在腫瘤組織中表達的意義，并進行二者之間相關(guān)性分析。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取自2011年10月25日-2012年10月25日來筆者所在醫(yī)院接受治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者180例的活體組織樣本和50例正常子宮組織制成蠟塊切片。子宮內(nèi)膜腺癌患者活體組織樣本中增生期內(nèi)膜40例，子宮內(nèi)膜增殖癥34例，子宮內(nèi)膜樣腺癌106例。患者年齡31～68歲，平均（46.8±10.2）歲。所有患者均為初治患者，且有明確的生存信息和臨床分期，所有患者手術(shù)切除的新鮮腫瘤標本經(jīng)中性福爾馬林固定后石蠟包埋，制成蠟塊保存。所有樣本均由兩名以上專業(yè)病理醫(yī)師確診，排除其他惡性腫瘤并發(fā)，排除繼發(fā)患者，排除其他重大疾病的患者。

1.2 方法

標本采集時應用FISH法檢測并記錄數(shù)據(jù)。應用EnViSion免疫組化二步法檢測患者腫瘤組織中GPR30、P-AKT，選用己知陽性的子宮內(nèi)膜腺癌切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。染色方法如下：（1）脫蠟和水化，取每張4 mm厚的患者腫瘤芯片，將組織芯片置于65 ℃恒溫中5 h；再將其先后加入到二甲苯Ⅰ和Ⅱ溶液里浸泡15 min隨后將其放入C2H5OH Ⅰ和Ⅱ各沖洗5 min，在無水乙醇Ⅱ中再浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min；蒸溜水中浸泡5 min。（2）抗原修復，取一定量的0.01 M梓檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）進行加熱；將組織置于緩沖液中并置于加熱箱中繼續(xù)加熱10～15 min；隨后將其冷卻，并用蒸餾水和PBs緩沖液沖洗3次，5 min/次[4]。（3）免疫組織化學染色，用蒸餾水配置新鮮的3% HA，室溫封閉15 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗2次，5 min/次；再用PBS洗兩次，持續(xù)5 min；應用山羊血清對標本進行密封，室溫60 min；取出切片，繼續(xù)用PBS緩沖液進行3次沖洗，共15 min；滴加即用型快捷免疫組化Max Vision二抗試劑，濕盒中室溫靜置15 min；PBS洗

3次，5 min/次；將其置于DAB中維持2～8 min，實時在鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GPR30與P-AKT的高表達與基因擴增之間的重疊率

GPR30的免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達率為58.8%（106/180），其中+28例，++69例，+++9例，而FISH檢測結(jié)果顯示GPR基因擴增率為51.1%（92/180），重疊率為74.5%（79/106）。P-AKT免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達率為58.8%（106/180），其中+31例，++52例，++23例，而FISH檢測結(jié)果顯示P-AKT基因擴增率為36.7%（66/180），重疊率為56.6%（60/106）。二者各個免疫組化間的重疊率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 二者在正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達情況

GPR30在正常子宮內(nèi)膜中陽性表達率明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌內(nèi)陽性表達率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。說明子宮內(nèi)膜腺癌患者的子宮內(nèi)膜組織中GPR30和P-AKT表達升高，即GPR30和P-AKT與子宮內(nèi)膜腺癌之間可能存在因果聯(lián)系，見表2。

2.3 GPR30、P-AKT與相關(guān)因素的相關(guān)性分析

GPR30和P-AKT的表達與患者的年齡、組織分化程度、是否出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移以及基層浸潤深度有關(guān)（P<0.05）。因此，在臨床治療過程中可根據(jù)GPR30和P-AKT判斷組織分化程度和基層浸潤深度，在明確診斷上有一定的意義，見表3。

2.4 GPR30和P-AKT相關(guān)性研究

經(jīng)過資料取證及統(tǒng)計學分析可知，GPR30和P-AKT之間存在明顯的相關(guān)性（字2=14.08，P<0.05，Φ=0.2693），說明CPR30和P-AKT之間能夠相互影響，見表4。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性群體中最為第二大的生殖道腫瘤。有人以循證醫(yī)學的方式通過Mata分析對幾千例子宮內(nèi)膜癌患者進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)患病者的病因與不良的生活方式以及惡性工作環(huán)境有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，孕激素與雌激素平衡被破環(huán)后，孕激素失去拮抗作用，容易增加子宮內(nèi)膜癌的風險，而究竟是孕激素還是雌激素是導致子宮內(nèi)膜腺癌的主要因子且致病機制尚不明確[5-9]。目前公認的為“核轉(zhuǎn)錄效應”，即雌激素與其受體相結(jié)合后激發(fā)核內(nèi)相關(guān)遺傳物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，合成相應蛋白，促進腺癌細胞增殖。近期研究表明，除此機制外，雌激素還可以激活AKT信號系統(tǒng)，是通過與GRP30受體相結(jié)合實現(xiàn)。GRP30廣泛的存在于人體，其與雌激素結(jié)合能夠迅速的激活并促使AKT發(fā)生磷酸化即P-AKT，而P-AKT能夠促進癌細胞生長。而關(guān)于GRP30與p-AKT之間的關(guān)系尚不清楚，因此，本文旨在通過對近一年來筆者所在醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜腺癌患者的生物樣本進行實驗室研究，分析GPR30和P-AKT在腫瘤組織中表達的意義，并進行二者之間相關(guān)性分析。

GPR30的免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達率為58.8%（106/180），而FISH檢測結(jié)果顯示GPR基因擴增率為51.1%（92/180），重疊率為74.5%（79/106）。P-AKT免疫組化結(jié)果顯示其陽性表達率為58.8%（106/180），而FISH檢測結(jié)果顯示P-AKT基因擴增率為36.7%（66/180），重疊率為56.6%（60/106）。二者的各個免疫組化間的重疊率差異顯著，如要進行多組間的兩兩比較需要進行SNK-q檢驗，說明FISH法與EnViSion免疫組化法檢測GPR30和P-AKT重疊率較好；經(jīng)過資料取證及統(tǒng)計學分析可知，GPR30在正常子宮內(nèi)膜中陽性表達率明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌內(nèi)陽性表達率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；P-AKT在正常子宮內(nèi)膜中陽性表達率明顯低于子宮內(nèi)膜腺癌內(nèi)陽性表達率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；GPR30和P-AKT的表達與患者的年齡、組織分化程度、是否出現(xiàn)淋巴道轉(zhuǎn)移及基層浸潤深度有關(guān)；經(jīng)過資料取證及統(tǒng)計學分析可知，GPR30和P-AKT之間存在明顯的相關(guān)（字2=14.08，Φ=0.2693），說明GPR30和P-AKT與子宮內(nèi)膜腺癌之間可能存在因果聯(lián)系，且CPR30和P-AKT之間能夠相互影響，在臨床治療過程中可根據(jù) GPR30和P-AKT判斷組織分化程度和基層浸潤深度，在明確診斷上有一定的意義。

綜上所述，雌激素能夠與GRP30結(jié)合并迅速激活P-AKT通路，釋放因子促進癌細胞增殖。在子宮內(nèi)膜腺癌組織內(nèi)二者表達水平均高于正常子弄內(nèi)膜組織，且二者之間可能存在一定的因果聯(lián)系，能夠應用于臨床上對子宮內(nèi)膜腺癌進行進一步診斷。

參考文獻

[1]曲長萍.自噬相關(guān)基因ARHI、Beclin1在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達及意義[D].長春：吉林大學，2013.

[2]鄒建平.Gankyrin、β-catenin蛋白與子宮內(nèi)膜腺癌關(guān)系的研究[D].長沙：中南大學，2014.

[3]熊兵紅.MiR-21通過PTEN/PI3K/AKT信號通路調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學，2014.

[4]王華英，沈磊，孫織. 40歲以下子宮內(nèi)膜腺癌患者的孕激素治療-附六例報告及文獻復習[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2006，4（28）：237-241.

[5]王美麗，吳中明，敖第書，等.雌激素、孕激素對雌激素受體、孕激素受體陰性子宮內(nèi)膜腺癌細胞系JEC裸鼠皮下移植瘤生長的影響[J]. 四川動物，2012，4（9）：638-640，508.

[6]胡艷艷.PI3K/Akt/GSK-3β和線粒休ATP敏感鉀通道介導原花青素對心肌缺血再灌注損傷的保護作用[D].濟南：山東大學，2013.

[7]葛新.G蛋白偶聯(lián)雌激素受體介導子宮內(nèi)膜癌細胞雌激素的非轉(zhuǎn)錄效應的研究[D].鄭州：鄭州大學，2013.

[8]郭瑞霞，郭會敏，苑中甫，等. G蛋白偶聯(lián)受體30和磷酸化AKT在子宮內(nèi)膜腺癌中表達及意義[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2009，12（4）：881-884.

[9]劉姝，張輝，趙興波，等.子宮腺肌病中PTEN和Akt的表達及其相關(guān)性研究[J].山東大學學報（醫(yī)學版），2009，10（5）：86-90.

（收稿日期：2016-11-18）