咖啡種質資源DNA指紋圖譜的構建

黃麗芳　董云萍　王曉陽　孫燕　陳鵬　林興軍　閆林

摘 要 選用4份咖啡種質資源為材料，對S1-S100共100個RAPD引物進行篩選，選出多態性好的引物10個。利用這10個RAPD引物對28份咖啡資源進行擴增，共獲得86條帶，平均每個RAPD引物擴增出8.6條帶，多態性譜帶74條，多態性條帶比率為86.0%。結果表明：供試咖啡種質資源遺傳多樣性較豐富；10個多態性好的RAPD引物中S8的鑒別效率最高，能將全部供試材料全部區分開，通過整合軟件錄入如所屬種類、種質名稱、采樣地點、引物、RAPD-PCR 擴增數據以及電泳圖片等相關信息，形成指紋圖譜二維編碼，構成咖啡種質資源的DNA指紋圖譜，為咖啡種質資源品種權益保護及分子身份證構建奠定了基礎。

關鍵詞 咖啡 ；種質資源 ；RAPD ；指紋圖譜

中圖分類號 TS273 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.008

咖啡（Coffea spp.）為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）多年生常綠灌木或小喬木，原產非洲北部和中部的熱帶地區。咖啡屬植物約有100多個種，通常所指的咖啡為小粒種、中粒種、大粒種和查理種。目前全世界馴化栽培的主要有小粒種（C. arabica L.）和中粒種（C. canephora Pierre），面積約占70%和30%[1-3]。小粒種咖啡為異源四倍體種，自花授粉，而其他種均為二倍體，異花授粉。實際生產中，咖啡生產者在來源或者遺傳背景不甚明了的情況下進行雜交或嫁接，以及地域間的引種利用等造成咖啡品種品系良莠不齊，變異性大，產生了大量的同物異名和同名異物，導致種子、種苗市場混亂的局面，阻礙咖啡產業的健康發展。傳統的咖啡品種真實性和純度是通過形態學、化學物質含量分析或者進行杯品等方法鑒定的[4-6]，耗時長、成本高、較難做到準確鑒別咖啡品種基因型。因此，對咖啡的核心種質的構建、種質的分類及真偽鑒定、品種權益保護等方面的研究顯得十分必要。

DNA指紋圖譜（DNA fingerprint）是鑒別不同品種、品系和不同無性系、不同基因型，以及辨別親本與雜交后代遺傳相關等方面的有力工具[7-9]，RAPD標記是以PCR為基礎，采用隨機引物對未知序列的DNA進行檢測，根據擴增的多態性來反映基因組DNA相應區域的遺傳關系，具有實驗操作流程簡單、所需儀器設備少、快速簡便，通用性好，且無須事先知道目的DNA片斷序列信息等許多優點，在生物的遺傳多樣性檢測、品系鑒定、遺傳圖譜構建和系統學等領域得到廣泛運用[10-12]。

近年來，咖啡的分子標記研究也取得了一些進展。王曉陽等[13]從514對SSR引物中篩選出1對特異性引物進行中小粒種咖啡的鑒定。該引物在小粒種中可擴增出雙帶，在中粒種中擴增出單帶，從擴增產物的條帶數目即可進行中小粒咖啡的鑒別。黃麗芳等[14]用篩選獲得的18條RAPD多態性引物對72份咖啡種質資源進行RAPD擴增，結果表明，咖啡資源在種的分類水平上存在遺傳關系多樣性，部分資源的分類學地位與地理來源無相關性。本文利用RAPD標記技術，對28份咖啡資源進行遺傳多樣性分析，并篩選出穩定的，多態性好的RAPD引物，構建DNA指紋圖譜，為咖啡資源的分子身份證構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為28份咖啡種質資源，其中大粒及查理種咖啡5份（編號1～5），小粒種咖啡10份（編號6～15），中粒種咖啡13份（編號16～28）。材料采自于海南，云南省德宏熱帶農業科學研究所（簡稱德宏所），云南省農業科學院熱帶亞熱帶經濟作物研究所（簡稱熱經所），中國熱帶農業科學院香料飲料研究所（簡稱香飲所）。詳見表1。

1.2 基因組DNA的提取

采用CTAB改良法進行咖啡葉片基因組DNA的提取[15]。提取的DNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測質量，稀釋至20 ng/μL，置于-20℃保存備用。

1.3 引物篩選及RAPD擴增

利用4份差異較大的咖啡模板，對RAPD引物S1-S100共100條隨機引物進行多態性篩選，從中選取多態性好且擴增條帶清晰的對實驗樣品進行擴增。引物由上海生工生物工程技術股份有限公司合成。

PCR反應體系為本課題組優化過的咖啡RAPD反應體系[16]：20 μL體系中，含ddH2O 13.75 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.6 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.2 μL，引物（10 μmol/L）1.2 μL，Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，基因組DNA（20 ng/μL）1 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94℃變性1 min，38℃退火1 min 45 s，72℃延伸2 min，反應40個循環；72℃再延伸7 min。擴增產物通過1.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察，以DL 2 000 Marker為參照，試驗重復2次。

1.4 數據分析

根據擴增引物的遷移率，利用人工方法統計讀帶，將清晰度高、重復性好的擴增條帶賦值“1”，無條帶或肉眼分辨不清的弱帶賦值“0”，導入Excel 表格生成數據矩陣。通過多態性條帶比率、品種最大相似系數及品種聚類區分率（Rate of distinguishing variety by cluster，RDVC）鑒別引物。采用NTSYSpc 2.1軟件，根據Nei和Li相似系數計算遺傳相似性GS（genetic similarity），根據非加權算術平均法（UPGMA）進行聚類分析。RDVC=（N-Ni）/N，Ni 為無法區分品種數，N為品種總數。

1.5 指紋圖譜構建

根據RAPD電泳擴增結果，從多態性比較豐富的引物中選出至少一條可將所有供試品種區分且表現優異的RAPD引物，構建咖啡品種（系）的DNA指紋圖譜。咖啡的DNA指紋圖譜一部分是RAPD擴增數據，由二進制代碼組成，另一部分是結合草料二維碼在線生成器（www.cli.im）將咖啡的種質名稱、種屬、采樣地點、引物名稱、RAPD數據代碼[17]，RAPD-PCR擴增數據圖片等信息錄入軟件中，形成指紋圖譜二維編碼[18]，可以更加快捷方便的進行實際應用。詳見表2。

2 結果與分析

2.1 RAPD引物篩選與擴增片段多態性

以4份差異較大的咖啡基因組DNA為模板，對S1-S100共100個RAPD引物進行多態性篩選，篩選出10個多態性較好的引物。利用這10個引物對28份材料基因組DNA進行PCR擴增，擴增出的位點多態性數目為5～12條，產物片段大小介于350～2 000 bp ，以引物S8和S19擴增的位點數最多，10個引物共擴增出86個位點，平均每個引物擴增出8.6條譜帶，其中多態性帶74條，多態性條帶比例為86.0%，其中S8引物多態性最為豐富。詳見表3。

2.2 聚類分析

28份咖啡材料間的相似性系數變幅為0.337 8～0.905 4。其中小粒種喀麥隆（13）和中粒種熱研2 號（17）的相似系數最小，為0.337 8，說明二者間的遺傳距離最遠，遺傳差異最大。小粒種CCC24（8）和鐵畢卡（11），中粒種興32（24）和興30（26）相似系數最大，都為0.905 4，表明它們之間的遺傳距離最小，遺傳差異最小。從種內遺傳相似系數看，2份大粒種的相似系數為0.635 1，查理種種內最小相似系數為查理中果（4）和查理大果（5），為0.702 7，最大相似系數為查理小果（3）和查理大果（5），為0.878 4。小粒種CATIMOR P88（7）和巴布亞新幾內亞（14），中粒種興32（24）和興31（25），它們種內最小相似系數分別為0.662 2和0.608 1。

UPGMA 聚類結果（圖1）分析，該聚類圖在相似性系數為0.608水平下可劃分為3大類。第Ⅰ類群包括5份材料，包括2份大粒種和3份查理種，第Ⅱ類群包括全部13份中粒種材料，第Ⅲ類群包括了全部的小粒種。聚類分析結果表明，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3大類群種間關系清晰，聚類結果與經典分類結果一致。

2.3 指紋圖譜的構建

根據10條引物擴增譜帶的多態性，能將供試的28份咖啡材料全部區分開。但從單條RAPD引物的聚類分析顯示，10條多態性較好的引物中只有引物S8能將所有供試材料一次性區分開，10條引物檢測效率如表3。引物S8的多態性帶數是12條，多態性百分率100%，品種最大相似性系數為0.916 7，品種聚類區分率為100%，為最有效的引物。其次為引物S11、S19，品種最大相似性系數為1，品種聚類區分率為53.57%，有13個品種無法區分開。僅用引物S8就能將所有參試品種有效區分，故選用S8的分子數據用于咖啡種質資源DNA 指紋圖譜的構建。

利用草料二維碼在線生成器對所有供試材料進行編碼，為每份材料建立了1個DNA 指紋圖譜編碼，其中包含了所屬種類、種質名稱、采樣地點、引物、RAPD-PCR擴增數據以及電泳圖片，從而得到二維碼結果。如圖2-A為印度，包含以下信息：所屬種類大粒種，種質名稱印度、采樣地點德宏所、引物S8、RAPD-PCR擴增數據為000000011100，以及圖2-A電泳圖；圖2-B為巴西，包含以下信息：所屬種類小粒種，種質名稱為巴西，采樣地點為熱經所，引物S8，RAPD-PCR擴增數據為000000001110，電泳圖2-B；圖2-C為印度，包含信息，種類為中粒種，種質名稱為興28，采樣地點為香飲所，引物S8，RAPD-PCR擴增數據為110001000110，電泳圖2-C。28份咖啡資源的RAPD數據見表3。

3 討論

任何一種分子標記在實際運用中都有各自的優缺點。RAPD 分子標記技術易受多種因素的影響，因其利用的是非特異引物，擴增結果的穩定性是相對的。但可通過多次實驗摸索建立適合該物種的一套反應條件，得到令人滿意的擴增結果[19-21]。

本研究所用的咖啡RAPD反應體系及程序等都經本課題組反復多次實驗驗證，篩選出的最優反應條件。從研究結果可看出，同一條引物在各個咖啡樣品間和不同引物在相同的咖啡樣品上多態性帶數和擴增總帶數的差異較顯著，說明供試的基因組DNA多態性較豐富，也表明了RAPD標記是研究咖啡種質資源親緣關系和構建咖啡指紋圖譜的有效方法。

本研究篩選出的10條RAPD引物對28份咖啡材料進行PCR擴增，共擴增出86條帶，平均每條引物擴增出8.6條帶，多態性條帶共74條，占總數的86%，相似性系數變幅為0.337 8～0.905 4，多樣性較豐富，這與此次試驗的選材也有一定關系，收集的28份咖啡樣品為生產或科學研究上具有代表性的咖啡品種（品系），涵蓋了咖啡屬的4個種，其中小粒種和中粒種居多，大粒種和查理種因其抗逆性較好，目前在科學研究中較多用于作砧木。

為了降低成本和提高樣品的檢測效率，在構建DNA指紋圖譜時，原則之一就是利用較少的引物分開盡量多的品種，這就意味著所用的引物多態性和穩定性要好。10條引物中，S8多態性條帶12條，多態性百分率為100%，品種聚類區分率100%。因此，選擇引物S8構建DNA指紋圖譜。若在試驗材料增加時，單條引物不能區分所有供試材料，可在引物S8的基礎上增加多態性較好的引物，如S11、S19，利用引物組合區分出所有品種[22]。

DNA指紋代碼構建指紋圖譜的信息有限，而二維碼技術可進行信息數據錄入。本文首次將DNA指紋代碼結合二維碼技術應用在咖啡研究中，從而生成咖啡二維碼，可更方便快捷地供研究人員進行對比和鑒定，為建立咖啡的網絡數據庫提供直觀有效的數據支持。最終產生的信息也可錄入到咖啡產品的物流信息中，從而形成一條完整的咖啡產品物流信息鏈，為咖啡產品在市場上的健康持續發展提供技術支持。

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