實時熒光定量PCR在兒童繼發性血流感染中的應用

黃君華，張書婉(西安醫學院醫學技術系,西安 700;西安市兒童醫院檢驗科)

摘要： 目的 探討熒光定量PCR(fluorescence real-time quantitative PCR,FQ-PCR)在檢測兒童血流感染病原菌中的作用,探究原發感染部位細菌載量與繼發性血流感染及培養陽性率之間的關系。 方法 收集14例原發感染部位培養鑒定為鮑曼不動桿菌且懷疑有繼發性血流感染的患兒標本,提取細菌DNA并進行16S rDNA-PCR和SYBR Green熒光定量PCR,對原發部位標本和血液標本的定量結果及血培養結果進行統計學分析。 結果 14例原發部位標本(9例肺泡灌洗液標本,5例腹水標本)熒光定量PCR均有結果,細菌載量的中位數(四分位數)為5.64×106(3.15×105,4.345×107)CFU/ml,相對應的14例血液標本也均得到PCR結果,細菌載量的中位數(四分位數)為1.585×105(2.315×103,5.817×105)CFU/ml,二者差異具有統計學意義(Z=-2.941,P<0.01);血培養10份陽性,細菌載量的中位數(四分位數)為2.90×105(1.058×105,1.057×106) CFU/ml,4份培養陰性,細菌載量的中位數(四分位數)為1.79×103(8.60×102,2.315×103)CFU/ml,二者差異也具有統計學意義(Z=-2.828,P<0.01)。 結論 兒童繼發性血流感染原發部位的細菌載量比血液中高,血液中細菌載量在105 CFU/ml上時可使血培養陽性。

實時熒光定量PCR在兒童繼發性血流感染中的應用

黃君華1，張書婉2(1西安醫學院醫學技術系,西安 710021;2西安市兒童醫院檢驗科)

摘要： 目的 探討熒光定量PCR(fluorescence real-time quantitative PCR,FQ-PCR)在檢測兒童血流感染病原菌中的作用,探究原發感染部位細菌載量與繼發性血流感染及培養陽性率之間的關系。 方法 收集14例原發感染部位培養鑒定為鮑曼不動桿菌且懷疑有繼發性血流感染的患兒標本,提取細菌DNA并進行16S rDNA-PCR和SYBR Green熒光定量PCR,對原發部位標本和血液標本的定量結果及血培養結果進行統計學分析。 結果 14例原發部位標本(9例肺泡灌洗液標本,5例腹水標本)熒光定量PCR均有結果,細菌載量的中位數(四分位數)為5.64×106(3.15×105,4.345×107)CFU/ml,相對應的14例血液標本也均得到PCR結果,細菌載量的中位數(四分位數)為1.585×105(2.315×103,5.817×105)CFU/ml,二者差異具有統計學意義(Z=-2.941,P<0.01);血培養10份陽性,細菌載量的中位數(四分位數)為2.90×105(1.058×105,1.057×106) CFU/ml,4份培養陰性,細菌載量的中位數(四分位數)為1.79×103(8.60×102,2.315×103)CFU/ml,二者差異也具有統計學意義(Z=-2.828,P<0.01)。 結論 兒童繼發性血流感染原發部位的細菌載量比血液中高,血液中細菌載量在105CFU/ml上時可使血培養陽性。

繼發性血流感染； 熒光定量PCR； 細菌載量； 血培養

繼發性血流感染為有明確感染部位來源的血流感染,與原發性血流感染在病原菌譜、細菌耐藥和死亡危險因素上有很大不同[1,2],其中由非發酵革蘭陰性桿菌引起的下呼吸道來源血流感染者病死率最高[1]。然而目前血流感染的診斷主要依靠血培養(blood cultivation,BC),但血培養敏感性低,易產生假陰性,給臨床診斷和抗生素的及時合理應用造成困擾。本研究旨在通過對有明確原發感染部位且懷疑有繼發性血流感染的患兒標本同時進行培養和熒光定量PCR,旨在探求原發部位細菌載量、血流中細菌載量和血培養陽性三者之間的關系,探討熒光定量PCR在檢測繼發性血流感染病原菌中的作用,為臨床懷疑繼發血流感染但血培養陰性的情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及實驗菌株

選取西安市兒童醫院收治的14例懷疑有繼發性血流感染(發熱>38 ℃或低體溫<36 ℃,可伴有寒戰等全身中毒癥狀或中性粒細胞增多伴核左移等)的患兒為研究對象,14例患兒的原發感染部位均培養鑒定出鮑曼不動桿菌,其中9例為肺部感染(肺泡灌洗液培養出鮑曼不動桿菌),5例為腹部感染(腹水培養出鮑曼不動桿菌);嚴格按照無菌操作流程采集每位患兒的原發感染部位標本和外周靜脈血各5 ml,其中1 ml注入BD公司EDTA-K2抗凝管,4 ml進行培養,血培養24 h仍無報警視為陰性,培養陽性細菌經VITEK全自動細菌生化藥敏鑒定儀鑒定到種。質控菌株為鮑曼不動桿菌ATCC19606。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將1 ml標本(肺泡灌洗液、腹水或血液)12 000 r/min離心5 min,取沉淀于4 ℃暫存。提取時先用100 μl 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液重懸沉淀,加入20 μl溶菌酶(10 mg/ml),37 ℃水浴30 min后應用QIAamp Blood DNA Mini Kit試劑盒,即加入20 μl QIAGEN Protease 和200 μl Buffer AL,混勻后56 ℃水浴10 min,冷卻至室溫后,加入200 μl預冷的無水乙醇,混勻,將所有溶液和絮狀沉淀物轉移到QIAamp Mini Spin column中,8 000 r/min離心1 min,然后加500 μl Buffer AW1,8 000 r/min離心1 min,再加500 μl Buffer AW2,14 000 r/min離心3 min,最后加入60 μl 72 ℃預熱的Buffer AE,8 000 r/min離心1 min得到DNA模板,具體操作步驟見文獻[3]。

1.2.2 16S rDNA-PCR擴增及測序比對 PCR擴增腹水、肺泡灌洗液和血液DNA提取物,其反應體系及條件見文獻[3]。擴增產物經純化后送上海生工生物工程有限公司測序,登陸http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi,將測序結果在GenBank中進行BLAST比對。

1.2.3 熒光定量PCR 應用CFX96TMReal-time定量PCR系統(美國Bio-rad)檢測,特異性引物參照文獻[4],上游引物5′-CAT TAT CAC GGT AAT TAG TG-3′,下游引物5′-AGA GCA CTG TGC ACT TAA G-3′擴增鮑曼不動桿菌的ITS區(internal transcribed spacer,內部轉錄間隔區)208 bp。20 μl反應體系,10 μl SYBR Green Realtime PCR Mix,10 μmol/L上下游引物各0.8 μl,DNA模板2 μl,ddH2O 6.4 μl,反應程序:95 ℃預變性5 min,進入循環95 ℃變性10 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s(采集熒光),經40個循環后進行溶解曲線分析:溶解曲線變溫范圍65 ℃→95 ℃,每5 s升高0.5 ℃。每份標本做三個重復管。通過軟件得到絕對定量的標準曲線(standard curve)、溶解曲線(melt curve)的Ct值、對數濃度值等數據。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件。數值不服從正態分布,進行兩獨立樣本非參數檢驗(Mann-WhitneyU秩和檢驗),P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 16S rDNA通用引物擴增

經16S rDNA-PCR檢測14份血液標本均為陽性,擴增產物與預期片段大小(615 bp)相符合,經測序均為鮑曼不動桿菌(見圖1)。

2.2 鮑曼不動桿菌定量結果

熔解曲線分析為單一峰圖,無非特異性擴增(見圖2)。

1-14.臨床血液標本;15.PCR陽性對照;16.PCR陰性對照;17.提取陰性對照; M.marker圖1 16S rDNA-PCR擴增血液標本Figure 1 The amplification of blood sample from 16S rDNA-PCR

A.標本檢測熔解曲線

B.標本檢測熔解峰圖

C.標本檢測擴增曲線圖2 鮑曼不動桿菌熒光定量PCR結果Figure 2 The result of FQ-PCR of Acinetobacter baumannii samples

2.3 14例臨床樣本血培養及熒光定量PCR結果

14例樣本的血液標本10例培養陽性,4份培養陰性。14份原發部位標本培養均為陽性,鮑曼不動桿菌含量在2.86×104-6.76×108CFU/ml之間(中位數5.64×106CFU/ml),血流中鮑曼不動桿菌的含量在6.70×102-7.05×106CFU/ml之間(中位數1.585×105CFU/ml),二者中位數差異具有統計學意義(Z=-2.941,P<0.01,見表1),說明兒童繼發性血流感染原發部位較血液中的細菌含量高;10例血培養陽性患兒的鮑曼不動桿菌熒光定量PCR值表明其血液中病原菌含量在7.52×104-7.05×106CFU/ml之間(中位數2.90×105CFU/ml),4例血培養陰性患兒血液中病原菌含量在6.70×102-2.37×103CFU/ml之間(中位數1.79×103CFU/ml),二者中位數差異具有統計學意義(Z=-2.828,P<0.01,見表1),說明血培養陽性與血液中細菌載量有關,需>105CFU/ml。

3 討論

繼發性血流感染為有明確感染部位來源的血流感染,在病因和病原菌構成等方面與原發性血流感染不同。目前繼發性血流感染的病原學診斷主要依靠外周血培養,然而繼發性血流感染往往在疾病前期就使用了抗菌藥物,導致血培養陽性率低,且培養方法計算的CFU只能代表在平板接種過程中存活下來的活的微生物而無法計數死細胞和不能形成菌落的細胞,因此人們對血流感染血液中病原菌的真正含量知之甚少[5],這些給臨床診治帶來困擾,所以我們需要一種更加快速敏感且不受抗菌藥物影響的能夠定量的方法來進行病原菌鑒定,而熒光定量PCR在這方面顯示出明顯優勢[6,7]。本文選取原發感染明確且疑似發生繼發性血流感染的患兒為研究對象,應用熒光定量PCR方法鑒定病原菌,對熒光定量PCR在檢測兒童血流感染病原菌中的作用及原發感染部位細菌載量與繼發性血流感染和培養陽性率之間的關系進行初步探討。

表1 14例疑似繼發性血流感染患兒臨床標本檢測結果

Table 1 The PCR results of blood samples and primary infection samples in 14 children with suspected secondary bloodstream infection

編號 標本類型 血培養 原發部位熒光定量PCR(CFU/ml)血液標本熒光定量PCR(CFU/ml)1肺泡灌洗液/血液-758×106143×1032肺泡灌洗液/血液-370×106215×1033腹水/血液-308×107237×1034腹水/血液-286×104670×1025肺泡灌洗液/血液+309×107705×1066肺泡灌洗液/血液+676×108180×1067肺泡灌洗液/血液+307×108353×1058肺泡灌洗液/血液+811×107809×1059肺泡灌洗液/血液+156×107201×10510肺泡灌洗液/血液+614×105752×10411腹水/血液+190×106506×10512腹水/血液+577×104390×10413肺泡灌洗液/血液+306×105227×10514腹水/血液+318×105116×105

本研究選取的14例研究對象原發部位為鮑曼不動桿菌感染,9例肺部感染,5例腹部感染,其外周血液病原菌定量結果在6.70×102-7.05×106CFU/ml之間(中位數1.585×105CFU/ml),說明14例患兒均發生了繼發性血流感染,但只有10例血培養陽性,經統計學分析我們發現4例培養陰性血標本病原菌定量結果(中位數1.79×103CFU/ml)與10例陽性的結果(中位數2.90×105CFU/ml)二者之間差異有統計學意義(Z=-2.828,P<0.01),說明血培養陽性與否和血液中病原菌的含量有關,本研究發現當外周血病原菌含量在105CFU/ml以上時血培養可為陽性。但培養陰性不僅與血培養的敏感性(菌量)有關,也與抗菌藥物的應用有關,據報道腦膜炎球菌在未經抗生素治療前,血培養檢出率可達50%,而在經過抗生素治療后,病原菌的檢出率不足5%[8,9]。Wellinghausen等[10]用real-time PCR檢測酵母菌血癥,發現在培養陰性而PCR陽性的患者中,超過50%經過了全身抗真菌治療。

另外,原發部位鮑曼不動桿菌含量在2.86×104-6.76×108CFU/ml之間(中位數5.64×106CFU/ml)與外周血病原菌含量(中位數1.585×105CFU/ml)二者之間的差異也有統計學意義(Z=-2.941,P<0.01),說明對于繼發性血流感染原發部位細菌載量較血液中高,但原發感染的菌量在何種情況下達到什么數量會引起繼發性血流感染仍需進一步探討。

綜上所述,實時熒光定量PCR技術能夠自動進行實時動態監測和數據分析,操作簡單、檢測速度快、定量精確、敏感度高且重復性好[11],檢測成本較傳統血培養低,可用于兒童血流感染的快速檢測;繼發性血流感染血培養結果與外周血中細菌量有關,對臨床血培養陰性的病例也應引起足夠重視。

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Application of real-time quantitative PCR in detection of secondary bloodstream infection in children

HUANG Junhua1,ZHANG Shuwan2

(1DepartmentofMedicalTechnology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2ClinicalLaboratory,Xi’anChildren’sHospital)

ObjectiveTo explore the value of fluorescence real-time quantitative PCR(FQ-PCR)for detecting the bacterial pathogen of bloodstream infection(BSI)in children,and to explore the relationship between the bacteria load in primary infection site and the incidence of BSI,the positive rate of culture.MethodsA total of 14 patients withAcinetobacterbaumanniiinfection in primary infection site and suspected secondary bloodstream infections were included.The bacteria DNA was extracted and analyzed by 16S rDNA-PCR and SYBR Green FQ-PCR.The results of quantitative bacteria load and blood culture(BC)were compared between primary infection samples and blood samples.ResultsAmong the 14 specimens(9 bronchoalveolar lavage fluid and 4 ascetic fluid),the medians(quartile)of bacteria load in primary infection sites and blood were 5.64×106(3.15×105,4.345×107) CFU/ml and 1.585×105(2.315×103,5.817×105) CFU/ml,respectively,and there was significant difference(Z=-2.941,P<0.01).The medians(quartile)of bacteria load in 10 positive BC and 4 negative BC were 2.90×105(1.058×105,1.057×106) CFU/ml and 1.79×103(8.60×102,2.315×103) CFU/ml,respectively,and there was also significant difference(Z=-2.828,P<0.01).ConclusionThe bacteria load in primary infection site is higher than that in blood,and blood culture might be positive if the bacteria load is>105CFU/ml in blood.

secondary bloodstream infection； FQ-PCR； bacteria load； blood culture

西安醫學院青年科研基金資助項目(2015QN09)

黃君華，男，1985-08生，碩士，講師，E-mail:huangjunhua1985@163.com

2016-12-08

R446

A

1007-6611(2017)03-0276-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.017