孕早期流產物的高通量測序研究

乞艷華，余珊珊，李小鵬，麻妙艷，鄔晉芳，周 琦*，雷小瑩

(1西安交通大學第二附屬醫院超聲科，西安 710032；2西安交通大學第二附屬醫院婦產科；*通訊作者，E-mail：13909232905@163.com)

孕早期流產物的高通量測序研究

乞艷華1，余珊珊1，李小鵬1，麻妙艷1，鄔晉芳2，周 琦1*，雷小瑩1

(1西安交通大學第二附屬醫院超聲科，西安 710032；2西安交通大學第二附屬醫院婦產科；*通訊作者，E-mail：13909232905@163.com)

目的 探討高通量測序技術在孕早期流產物檢測中的應用價值。 方法 收集2014-02～2016-10在西安交通大學第二附屬醫院就診的胚胎停止發育孕婦45例。取流產物組織，進行高通量測序及染色體核型分析。 結果 共收集到有效樣本44例，高通量測序11例(25.00%)在檢測范圍內未檢出已知致病性染色體畸變；19例(43.18%)染色體數目異常或嵌合體；14例(31.82%)染色體部分片段拷貝缺失或呈多態性。核型分析12例(27.27%)染色體數目異常或嵌合體。 結論 高通量測序技術對流產物的檢出陽性率高于核型分析，尤其在染色體微缺失和微重復檢出上有明顯優勢，可用于臨床上不明原因流產的病因學檢查。

高通量測序技術； 染色體核型分析； 流產

近年來，隨著國家計劃生育政策的調整以及人們生育觀念的轉變，高齡高危孕婦逐年增多。孕婦早期出血、胚胎停止發育者比例升高，引起了醫務工作者的注意。自然流產的病因復雜，包括胚胎染色體異常、孕婦內分泌失調、母胎血型不合、免疫因素、精神因素以及孕婦全身心疾病等都會導致流產的發生，其中胎兒染色體異常在早期流產中占據很大比例[1]。目前對染色體異常的檢測手段主要是核型分析，因受細胞培養及核型顯帶分辨率的影響，檢出率為5 Mb左右[2]。隨著高通量測序技術在產前診斷中的逐步應用，我們采用高通量測序技術檢測孕早期流產物，明確流產原因，為下次妊娠提供遺傳指導。

1 對象與方法

1.1 對象

2014-02～2016-10在西安交通大學第二附屬醫院就診的胚胎停止發育孕婦45例，孕婦年齡21-38歲，平均年齡30歲，孕周7-20周，平均孕周12周。45例孕婦均為自然受孕，26例為初次妊娠，19例為復發性妊娠，復發性流產中流產2次的共7例。

1.2 流產物測序及核型分析方法

取流產物10 mg，無菌PBS緩沖液沖洗，提取DNA，超聲波打斷使基因組DNA成小片段核酸。采用酶反應的方法，將打斷后的DNA小片段5′端突出末端補平或將3′端突出末端削平。T4 DNA連接酶將接頭連接在DNA片段兩端，瓊脂糖凝膠切膠回收合適范圍的片段。PCR擴增、純化，構建測序文庫。多個測序文庫index標記后測序，測序采用Hiseq2000高通量測序儀(美國Illumina公司)。對測得的序列片段與已知人類參考基因組比對(hgl9)進行數據分析。參照已發表研究中的Fused Lasso算法確定染色體片段的重復或缺失[3]。在全基因組水平篩選出待檢樣本的DNA重復或缺失區域，并將檢測數據與基因變異數據庫(database of genomic variants，DGV)、人類染色體變異數據庫(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensembl resources，DECIPHER)和在線人類孟德爾遺傳數據庫(online Mendelian inheritance in man，OMIM)進行匹配得出拷貝數變異的意義。

流產物核型分析：流產物采用常規消化法處理，5%CO2，37 ℃溫箱培養，收獲分離，滴片制片烤片，胰蛋白酶消化，吉姆薩染色，G顯帶，每例鏡下計數30個核型，分析5個核型，嵌合體加倍計數，必要時做C帶和N帶。G帶分辨率為320-400條帶。

2 結果

共計檢測45例流產物，其中1例因母源性污染被排除，因此有效樣本為44例，陽性結果見表1。

表1 流產物測序及核型分析結果

Table 1 The results of sequencing technology and karyotype analysis for the abortion

樣品編號核型分析結果高通量測序結果結果備注15SC3529未見異常13q31．1(83980001-84200000)×3?，重復片段大小為0．22Mb13號染色體長臂31．1區域重復，致病性未知15SC6202未見異常2p12，2p13．1(74920001-75240000)×3?，重復片段大小為0．32Mb2號染色體短臂12/13．1區域重復，致病性未知15SC3511未見異常4p11(48600001-49340000)×3?，重復片段大小為0．74Mb4號染色體短臂11區域重復，致病性未知15SC0189未見異常2p12(77320001-78140000)×3，重復片段大小為0．82Mb2號染色體短臂12區域重復，致病性未知15SC0721未見異常11q14．3(90020001-90160000)×1，缺失片段大小為0．14Mb11號染色體長臂14．3區域缺失，致病性未知15SC3521未見異常2p12(78640001-79940000)×3，重復片段大小為1．30Mb2號染色體短臂12區域重復，致病性未知16SC05685未見異常7q31．33處重復0．62Mb區域7號染色體長臂31．33區域重復，致病性未知16SC05745未見異常8p22-p21．3處重復0．62Mb區域8號染色體短臂22-21．3區域重復，致病性未知15SC6201未見異常7q34(138800001-159140000)×1?，缺失片段大小為20．34Mb；19q13．43(57960001-58500000)×3?，重復片段大小為0．54Mb7號染色體長臂34缺失區域，導致前腦無裂畸形、腎積水；19號染色體長臂13．43區域重，致病性未知15SC3525未見異常7q11．21(64680001-65180000)×1?，缺失片段大小為0．5Mb7號染色體長臂11．21區域缺失，致病性未知15SC3527未見異常14q11．2(19460001-20420000)×3，重復片段大小為0．96Mb14號染色體長臂11．2區域重復，致病性未知15SC0187未見異常20p12．3(8300001-12280000)×1，缺失片段大小為3．98Mb；20p12．1(13180001-14520000)×1，缺失片段大小為1．34Mb20號染色體短臂12．3區域缺失(與Alagillesyndrome相關，肝內膽管缺乏，膽汁郁積，心臟疾病，骨骼異常等)；20號染色體短臂12．1區域缺失，致病性未知

表1 流產物測序及核型分析結果 (續表)

Table 1 The results of sequencing technology and karyotype analysis for the abortion (continuing)

樣品編號核型分析結果高通量測序結果結果備注15SC1255未見異常8p23．3p21．1(160001-28480000)×1?，缺失片段大小為28．32Mb；8p21．1p12(28480001-31020000)×3?，重復片段大小為2．54Mb；12p11．1(34180001-34860000)×1?，缺失片段大小為0．68Mb8號染色體短臂28．32Mb的拷貝數缺失(表征：出生后生長遲緩，頭小畸形，智力障礙，特殊面容，先天性心臟缺損等)；8號染色體短臂2．54Mb拷貝數重復(致病性未知)；12號染色體短臂0．68Mb的拷貝數缺失(致病性未知)16SC05757未見異常22號染色體q13．31-13．33處缺失3．1Mb覆蓋了22q13deletionsyndrome(phelan-Mcdermidsyndrome)約90%的區域，包含關鍵基因SHANK3、ARSA，自閉癥，語言發育遲緩，智力障礙，張力減退，行為異常等15SC352316SC0569247，XN，+1647，XN，+1647，XN，+1647，XN，+16習慣性流產最為常見的一種，常表現為胎兒宮內生長受限以及先天性心臟缺陷。嵌合比例越高，異常表型越明顯16SC0623147，XN，+1647，XN，+1615SC3515未見異常47，XN，+16[75%]/46，XN[25%]15SC3520培養失敗48，XN，+7，+10[30%]/46，XN[70%]7號染色體三體：宮內生長受限，小頭畸形，皮膚色素改變，面部不對稱；10號染色體三體在孕早期流產，多有耳部畸形，唇腭裂，眼睛、心臟、腎臟和手足畸形16SC05682培養失敗48XN，+2，+13。該樣本為2號染色體三體，同時也為13號染色體三體2號染色體三體：胎兒宮內生長受限，室間隔缺損，面部畸形，胚胎早期停育等；13號染色體三體：發育遲緩，智力障礙，小眼畸形，腭裂，唇裂，隱睪癥，多指趾畸形，顱面部異常，大腦發育不全，腎臟畸形，心臟結構缺陷，胚胎早期停育16SC01328培養失敗49，XN，+13，+14，+21。該樣本為13號染色體三體，14號染色體三體，21號染色體三體14號染色體三體：宮內生長受限，精神運動發育遲緩，智力低下，頭面部異常以及心臟結構畸形；21號染色體三體表現：智力低下，特殊面容，心臟，胃腸道等畸形15SC351615SC019016SC0276215SC409916SC0568769，X1NN69，XNN69，XNN69，XNN未見異常69，XNN69，XNN69，XNN69，XNN69，XNN常在孕早期出現流產，表現：先天性心臟缺陷，生殖器畸形(男性)，腦部發育異常等15SC352245，X45，X特納綜合征(Turnersyndrome)，表現：身材矮小，性腺發育不良16SC0575545，X45，X16SC05760培養失敗21X21號染色體單體：先天性多重畸形(骨骼、心臟、眼部、肺部、腎部及泌尿系統)，胚胎早期停育15SC125316SC0569116SC0568347，XN，+2247，XN，+2247，XXY，+22[60%]/46，XN[40%]47，XN，+2247，XN，+22該樣本為47，XN，+22[65%]/46，XN[35%]的嵌合體22號染色體三體：是第三大非整倍體致自然流產的原因，小頭畸形，顱骨異常，先天性心臟病，腎臟畸形，胎兒宮內發育遲緩嵌合比例越高，異常表型越明顯15SC1252培養失敗70，XNN，+20三整倍體綜合征，孕早期出現流產，先天性心臟缺陷，生殖器畸形(男性)以及腦部發育異常等

高通量測序結果：11例在檢測范圍內未檢出已知致病性染色體畸變(見圖1A)，陰性率為25.00%(11/44)。19例染色體數目異常或嵌合體，占比43.18%(19/44)，其中5例69XNN(樣本編號15SC3516，15SC0190，16SC02762，15SC4099，16SC05687)、3例16-三體(樣本編號15SC3523，16SC05692，16SC06231)、2例22-三體(15SC1253，16SC05691)、2例45X(樣本編號15SC3522，16SC05755)、1例70XNN(樣本編號15SC1252)、1例21單體(樣本編號16SC05760)、2例多條染色體異常(樣本編號16SC05682，16SC01328)，3例多條染色體嵌合體(樣本編號15SC3515，15SC3520，16SC05683)(見圖1B，16-三體；圖1C,69，XNN)。14例檢測結果中存在染色體部分片段拷貝缺失或呈多態性，占比31.82%(14/44)(見圖1D)。

核型分析結果：5例培養失敗，27例未見異常，12例染色體數目異常或嵌合體(27.27%，12/44)。

A．流產物測序陰性結果B．流產物(16-三體)測序結果C．流產物(69，XNN)測序D．流產物(7號染色體部分缺失，19號染色體部分重復)測序

1-22號染色體用環形圖表示，內圈紅色表示該區域存在缺失，綠色表示該區域存在重復

圖1 不同流產物測序結果

Figure 1 The sequencing results of the abortion tissues

3 討論

在人類妊娠過程中，自然流產已成為一種非常重要的優勝劣汰法則。據資料統計，孕早期自然流產發生率占10%-15%，對患者產生較大的心理負擔。造成流產的病因非常復雜，如遺傳、免疫、解剖、內分泌、感染、環境及其他未知因素等，而遺傳因素對自然流產發生的影響更加突出，占50%-60%，其中染色體的異常最為常見[1]。

染色體異常的檢測手段隨著近年來生物檢測技術的發展而更加豐富多樣，如熒光原位雜交技術(FISH)、多重探針擴增技術(MLPA)、基因芯片法(arrayCGH、SNParray)等，這些技術雖能將檢出率提高一些，但是受限于技術原理，只能檢測到芯片探針覆蓋的染色體區域，這就限制了發現新的染色體畸變，因而限制了其臨床廣泛應用。高通量測序技術明顯優于其他技術[4]，可以覆蓋46條染色體非整倍體以及大于100 kb的染色體拷貝數變異(copy number variation,CNVs)，由于是全基因組均勻覆蓋，因此能發現芯片平臺未覆蓋到的CNVs[5]，進而發現新的染色體疾病，且還能檢出5%以上的嵌合體[6,7]。因此與其他技術相比更適用于臨床應用，有學者嘗試了羊水中游離胎兒DNA的測序，取得了較為理想的結果[8]。

我們用高通量測序及核型分析檢測了45例自然流產的絨毛組織，有效樣本44例。高通量測序共計檢出33例(75%)染色體異常，其中19例為染色體數目異常或嵌合體，占比43.18%，5例69XNN、3例16-三體、2例22-三體、2例45X、1例70XNN、1例21單體、2例多條染色體異常，3例多條染色體嵌合體。本研究結果發現，與早期流產密切相關的染色體異常為69XNN，16-三體及其嵌合體，22-三體等，未見集中在13號、18號、21號上，所以臨床上曾經選用FISH做流產物分析，因探針受限，常選擇13號、18號、21號、X、Y染色體探針進行流產物分析意義不大，檢出率低[9]。核型分析僅發現12例(27.27%)染色體異常，檢出率明顯低于高通量測序。高通量測序檢測出14例存在染色體部分片段拷貝缺失或呈多態性，占比31.82%，染色體的部分片段拷貝缺失或多態性，可能影響胚胎早期發育，但是其致病性未知，這一部分是需要更進一步研究改變和致病性間的關系。本研究結果與其他學者報道相一致[10]。2014年Liang等[11]研究發現從疑難家系揭示CNVs與疾病之間的關系，當CNVs缺失未達到一定的劑量時，相應缺失部分的基因補代償，疾病不表現，當缺失到達一定劑量，相應缺失部分的基因無法補償時產生臨床表現。

本研究中的高通量測序方法是單端測序，尚不能解決易位、倒位問題。隨著雙端測序，環形測序、單細胞測序，到文庫構建中優化后的CSMART(循環單分子擴張和重測序技術)、Meta pair(雙端末端配對測序)等方法的發展，解決易位、倒位、嵌合、微缺失、微重復、單基因、單親二倍體等都會成為現實。最新研究結果顯示，CSMART方法[12]已經成功產前無創診斷了Wilson單基因疾病，同樣也可應用于檢測其他單堿基變異、微缺失或插入等致病突變，而且還能運用于腫瘤早期診斷，定量血液中低水平的腫瘤特異性循環DNA和檢測患者對治療的反應。

綜上所述，高通量測序技術對流產物的檢出陽性率高于核型分析，尤其在染色體微缺失微重復檢出上有明顯優勢，可用于臨床上不明原因流產的病因學檢查。胚胎早期停止發育絕大多數是由胚胎染色體異常導致的。隨著高通量測序技術的不斷發展，流產物測序所能帶給人們的遺傳信息也會更加豐富，進一步后續研究缺失與致病性的關系顯得更為重要，這將為孕婦遺傳學咨詢開辟新的前景。

[1] Islam MM,Bakheit CS.Advanced maternal age and risks for adverse pregnancy outcomes：a population-based study in oman[J].Health Care Women Int，2015，36(10):1081-1103.

[2] Rajcan-Separovic E.Chromosome microarrays in human reproduction[J].Hum Reprod Update，2012，18(5)：555-567.

[3] Wang Y,Chen Y,Tian F,etal.Maternal mosaicism is a significant contributor to discordant sex chromosomal aneuploidies associated with noninvasive prenatal testing[J]．Clin Chem,2014,60(1):251-259.

[4] Cohen K,Tzika A,Wood H,etal.Diagnosis of fetal submicroscopic chromosomal abnormalities in failed array CGH samples:copy number by sequencing as an alternative to microarrays for invasive fetal testing[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2015,45(4):394-401.

[5] Wang Z,Andrews P,Kendall J,etal.SMASH,a fragmentation and sequencing method for genomic copy number analysis[J].Genome Res,2016,26(6):844-851.

[6] Ruttanajit T,Chanchamroen S,Cram DS,etal.Detection and quantitation of chromosomal mosaicism in human blastocysts using copy number variation sequencing[J].Prenat Diagn,2016,36(2):154-162.

[7] Campuzano O,Sarquella-Brugada G,Mademont-Soler I,etal.Identification of genetic alterations，as causative genetic defects in long QT syndrome，using next generation sequencing technology[J].Plos One,2014,9(12):e114894.

[8] Qi Q,Lu S,Zhou X,etal.Copy number variation sequencing-based prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA in amniotic fluid[J].Prenat Diagn,2016,36(6):576-583.

[9] 周佳,蔡彩萍,姚紅霞，等．FISH技術在檢測自然流產絨毛組織非整倍體異常中的應用研究[J].生殖與避孕,2013,33(5)：351-353.

[10] Liu S,Song L,Cram DS,etal.Traditional karyotyping vs copy number variation sequencing for detection of chromosomal abnormalities associated with spontaneous miscarriage[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2015,46(4):472-477.

[11] Liang D,Peng Y,LV W,etal.Copy number variation sequencing for comprehensive diagnosis of chromosome disease syndromes[J].J Mol Diagn,2014,16(5)：519-526.

[12] Lv W,Wei X,Guo R,etal.Non-invasive prcnatal testing for wilson disease by use of circulating single-molecule amplification and resequeneing technology(cSMART)[J].Clin Chem,2015,61(1):172-181.

Application of high-throughput sequencing technology for analying the abortion of the early pregnancy

QI Yanhua1,YU Shanshan1,LI Xiaopeng1,MA Miaoyan1,WU Jinfang2,ZHOU Qi1*,LEI Xiaoying1

(1DepartmentofUltrasound,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail：13909232905@163.com)

ObjectiveTo explore the value of high-throughput sequencing technique in detection of the abortion of the early pregnancy.MethodsForty-five cases of abortion tissue from Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University from February 2014 to October 2016 were selected.The tissues of abortion were collected to perform high-throughput sequencing technology and chromosomal karyotypes analysis.ResultsA total of 44 cases of effective samples were collected.The results of high-throughput sequencing technology showed that 11 cases(25.00%)were not found the known pathogenic chromosome aberration in the test range,and there were 19 cases(43.18%)of abnormal chromosome number or chimera and 14 cases(31.82%)of chromosome fragment copies part missing or polymorphism.Twelve cases(27.27%)of abnormal chromosome number or chimera were found by chromosomal karyotypes analysis.ConclusionThe positive rate of abortion tissue by high-throughput sequencing technology is higher than that of chromosomal karyotype analysis,especially in chromosome micro-deletion and micro-duplication.High-throughput sequencing technology is recommended to be applied to clinical diagnosis of unknown reason abortion.

high-throughput sequencing technology； chromosome karyotype analysis； abortion

陜西省社會發展科技攻關項目(2015SF126，2016SF014)

乞艷華，女，1981-10生，在讀博士，主治醫師，E-mail：18991188001@189.cn

2016-12-12

R741.21

A

1007-6611(2017)03-0271-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.016