耐性肽hCDR1誘發(fā)小鼠狼瘡樣病變的研究

孫玉石，楊 飛，暴玲玉，王 悅，趙鳳儀，焦 翔，楊 靜，施秉銀

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:shibingy@126.com)

耐性肽hCDR1誘發(fā)小鼠狼瘡樣病變的研究

孫玉石，楊 飛，暴玲玉，王 悅，趙鳳儀，焦 翔，楊 靜，施秉銀*

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:shibingy@126.com)

目的 探討基于人dsDNA抗體分子互補決定區(qū)1(CDR1)的耐受肽(tolerizing peptide)hCDR1作為致病原誘發(fā)小鼠狼瘡樣病變的可能。 方法 6-8周齡B6D2F1雌性小鼠40只,隨機分為hCDR1 20 μg組、100 μg組、500 μg組、陰性對照組和陽性對照組。完全弗氏佐劑乳化hCDR1,足跖及尾根部多點皮下注射免疫hCDR1組小鼠,間隔3周,不完全弗氏佐劑乳化hCDR1加強免疫1次;陰性對照組用不含hCDR1的佐劑皮下免疫,陽性對照組小鼠接受DBA/2小鼠脾臟及胸腺單細胞懸液尾靜脈注射形成慢性移植物抗宿主樣狼瘡鼠(SLE-cGVHD)。尿蛋白試紙監(jiān)測小鼠每周蛋白尿變化。首次免疫后9周采血,檢測血液常規(guī);ELISA法檢測血清中hCDR1抗體、dsDNA抗體、組蛋白抗體及總IgG抗體;留取腎臟,直接免疫熒光檢測腎臟免疫復合物沉積情況;HE染色觀察腎臟病理改變。 結果 hCDR1 100 μg組和500 μg組小鼠出現(xiàn)狼瘡樣改變。與陰性對照組相比,100 μg組小鼠和500 μg組小鼠血清dsDNA抗體、組蛋白抗體OD值增加(P<0.05);外周血血小板減少(P<0.05),白細胞增加(P<0.05);75%小鼠出現(xiàn)狼瘡樣腎臟改變,表現(xiàn)為尿蛋白陽性,腎小球增生以及腎小球基底膜IgG免疫復合物的沉積。20 μg劑量組小鼠及陰性對照組小鼠未出現(xiàn)狼瘡樣改變。 結論 hCDR1具有免疫原性,可以作為致病原誘發(fā)B6D2F1小鼠出現(xiàn)狼瘡樣病變。

狼瘡樣病變； 耐受肽； 移植物抗宿主??； 過繼免疫； 小鼠； hCDR1

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是以dsDNA抗體、組蛋白抗體、Sm抗體等多種自身抗體的產(chǎn)生為特點,累及全身多個臟器的一種難治性自身免疫性疾病[1]。新型免疫抑制劑及生物靶向藥物在改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者預后的同時也增加了感染的風險。因而,通過抗原表位肽誘導免疫耐受,作為一種新型的治療策略逐漸受到人們的重視。hCDR1是基于人dsDNA抗體分子互補決定區(qū)1(the complementarity determining region 1 of a human monoclonal anti-DNA autoantibody)設計合成的一段含有19個氨基酸分子多肽。大量研究證實,hCDR1可以在自發(fā)性狼瘡小鼠(NZB×NZW)F1及因移植了狼瘡患者外周血淋巴細胞而表現(xiàn)出狼瘡樣改變的SCID小鼠體內(nèi)重新誘導免疫系統(tǒng)對自身抗原的耐受,減緩疾病的發(fā)生和發(fā)展[2-5]。然而,關于hCDR1的免疫原性以及是否會作為致病原誘發(fā)機體產(chǎn)生狼瘡病變的研究目前尚無報道。慢性移植物抗宿主狼瘡樣小鼠(SLE-cGVHD)外周血中可檢測到dsDNA抗體、組蛋白抗體等狼瘡特異性抗體,小鼠腎病理可見典型狼瘡腎炎病理改變。由于上述類似于人類SLE的表現(xiàn),SLE-cGVHD被廣泛應用于狼瘡相關的研究[6-8]。本研究通過hCDR1免疫小鼠,并將其與SLE-cGVHD模型進行比較,明確hCDR1是否會誘發(fā)無免疫缺陷小鼠產(chǎn)生狼瘡樣病變,為以后hCDR1的安全應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

近交系DBA/2(H2d)雌性小鼠16只,6-8周齡,SPF級,雜交系B6D2F1(H2d/b)雌性小鼠40只,6-8周齡,SPF級,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心飼養(yǎng)。所有動物實驗均符合西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心管理委員會有關動物管理和使用的規(guī)定。

1.2 多肽及主要試劑

hCDR1多肽-GYYWSWIRQPPGKGEEWIG,由上海英駿生物技術有限公司合成;尿蛋白試紙,購自廣州市花都高爾寶生物技術有限公司;小牛胸腺DNA、小牛胸腺組蛋白、TMB購自美國Sigma公司;山羊抗小鼠IgG、HRP-山羊抗小鼠IgG,購自北京博奧森生物技術有限公司;FITC-山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋物技術有限公司。

1.3 動物分組及干預

適應性飼養(yǎng)小鼠1周,飼養(yǎng)室溫度22 ℃,濕度為(50±5)%,光照周期為12 h ∶12 h。將B6D2F小鼠隨機分為5組:hCDR1 20 μg組、100 μg組、500 μg組、慢性移植物抗宿主狼瘡樣鼠(SLE-cGVHD)陽性對照組、陰性對照組,每組8只小鼠。

hCDR1免疫小鼠:無菌PBS溶解hCDR1并稀釋為0.2 mg/ml，1 mg/ml，5 mg/ml。取上述溶液與等量完全弗氏佐劑混勻,完全乳化。取200 μl混合液對hCDR1免疫組小鼠在足跖及尾根部多點皮下注射免疫。首次免疫后3周,不完全弗氏佐劑乳化hCDR1加強免疫1次,hCDR1劑量同首次免疫。陰性對照組用不含hCDR1的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑同樣程序免疫小鼠。SLE-cGVHD模型組的誘導:無菌取DBA/2小鼠的脾臟和胸腺并制備成單細胞懸液,調(diào)整細胞懸液至2.5×108/ml,將單細胞懸液按照200 μl/只的劑量經(jīng)尾靜脈注入B6D2F1小鼠體內(nèi),首次注射記為第0天,在0，4，7，10 d分別免疫小鼠。

1.4 尿蛋白的測定

首次免疫前和首次免疫后每周采集小鼠晨尿,用尿蛋白試紙測尿蛋白量。根據(jù)試紙顯色程度判斷尿里蛋白含量:陰性≤10 mg/dl;+,10-30 mg/dl;++,30-100 mg/dl;+++,300-1 000 mg/dl;++++,>1 000 mg/dl。

1.5 血液常規(guī)測定外周血紅細胞、血小板和白細胞

首次免疫后第9周,水合氯醛麻醉小鼠后摘眼球取血。全自動血細胞分析儀JM-8800測定小鼠血液常規(guī)指標。

1.6 血清抗hCDR1抗體、組蛋白抗體、dsDNA抗體及總IgG抗體的測定

首次免疫后9周,麻醉小鼠眼球取血,4 000 r/min離心10 min,取上清,-80 ℃存貯備用。hCDR1抗體測定:酶聯(lián)板紫外照射15 min,加入100 μg/ml hCDR1 100 μl,4 ℃過夜,3%BSA 37 ℃封閉2 h,100 μl 1 ∶40稀釋的待測血清樣品,37 ℃孵育1 h,100 μl 1 ∶3 000稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG抗體,37 ℃孵育1 h。每次孵育后PBST洗板3次,甩干。100 μl TMB溶液,室溫下顯色15-30 min,50 μl 2 mmol/L的H2SO4終止顯色,波長450 nm測定光密度值。血清抗雙鏈DNA抗體測定:酶聯(lián)板紫外照射后加入100 μl 100 μg/ml的L-多聚賴氨酸預包被,室溫下放置2 h,去離子水清洗并甩干,100 μl 100 μg/ml小牛胸腺DNA 100 μl包被酶聯(lián)板。其余操作與抗hCDR1抗體測定相同。組蛋白抗體測定:20 μg/ml小牛胸腺組蛋白包被酶聯(lián)板,其余操作與抗hCDR1抗體測定相同。血清總IgG水平測定:用10 μg/ml山羊抗小鼠IgG包被酶聯(lián)板,其余操作與抗hCDR1抗體測定相同。在測定hCDR1抗體、組蛋白抗體、dsDNA抗體時血清稀釋倍數(shù)為1 ∶40,測定總IgG時血清稀釋倍數(shù)為1 ∶40 000。

1.7 腎臟病理和直接免疫熒光

甲醛溶液固定小鼠右側(cè)腎臟,石蠟包埋并切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡觀察腎臟組織病理改變。左側(cè)腎臟液氮速凍后用OCT包埋,冰凍切片,FITC-山羊抗小鼠IgG孵育,37 ℃避光30 min,PBS洗去未結合的抗體,無熒光甘油封閉后熒光顯微鏡觀察。熒光強度的判定:-,高低倍鏡均不顯示;±,高倍鏡下隱約可見;+,低倍鏡下隱約可見,高倍鏡下可見;++,低倍鏡下可見,高倍鏡下清晰;+++,低倍鏡下清晰,高倍鏡下耀眼;++++,低倍鏡下耀眼,高倍鏡下刺眼。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠尿蛋白含量變化

與SLE-cGVHD組小鼠相似,hCDR1免疫組小鼠在首次免疫后第2周開始出現(xiàn)蛋白尿,多為+。第9周時,100 μg組75%小鼠出現(xiàn)蛋白尿,500 μg組62.5%小鼠出現(xiàn)蛋白尿,蛋白尿多為(+)-(++)。20 μg組小鼠及陰性對照組小鼠尿蛋白檢測結果始終為陰性。與SLE-cGVHD組小鼠相比,hCDR1免疫組小鼠蛋白尿較輕,在第9周時差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。

表1 不同時點各組小鼠尿蛋白含量分布情況比較

Table 1 Comparison of positive urinary protein in each group at different times

組別第3周第6周第9周-++++++++++-++++++++++-++++++++++陰性對照組800008000080000hCDR120μg組800008000080000 100μg組440003500023300 500μg組440003500032300陽性對照組431002510002231

與陰性對照組相比,100 μg組和500 μg組第6周和第9周均P<0.05,陽性對照組第3,6,9周均P<0.05;hCDR1不同濃度組與陽性對照組比較,第9周P<0.05

2.2 小鼠外周血紅細胞、血小板、白細胞的變化

首次免疫后9周檢測血常規(guī),hCDR1免疫組小鼠與SLE-cGVHD組小鼠外周血中紅細胞、血小板、白細胞變化趨勢一致。與陰性對照組小鼠相比,hCDR1 100 μg組、500 μg組及SLE-cGVHD小鼠外周血中血小板減少,白細胞升高,差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與SLE-cGVHD組小鼠比較,hCDR1免疫組小鼠血小板降低程度及白細胞升高程度均較低,差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。hCDR1 20 μg組小鼠與陰性對照組小鼠相比紅細胞、血小板、白細胞均無明顯差異(見圖1)。

A.各組小鼠外周血紅細胞比較 B.各組小鼠外周血血小板比較 C.各組小鼠外周血白細胞比較圖1 各組小鼠外周血紅細胞、血小板、白細胞比較Figure 1 Comparison of count of peripheral blood erythrocytes,platelets and leukocytes among different groups

2.3 hCDR1免疫小鼠血清自身抗體變化

首次干預后9周,留取小鼠血清測定相關抗體。與陰性對照組小鼠相比,hCDR1 100 μg組及500 μg組小鼠血清中hCDR1抗體、dsDNA抗體、組蛋白抗體和總IgG均增加,差異具有統(tǒng)計學意義(見圖2)。hCDR1 20 μg組小鼠,hCDR1抗體及總IgG較陰性對照組顯著增加,dsDNA抗體及組蛋白抗體與陰性對照組相比無顯著差異。與SLE-cGVHD組小鼠相比,hCDR1免疫組小鼠血清中dsDNA抗體,組蛋白抗體升高幅度小但差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

圖2 各組小鼠血清中相關抗體檢測Figure 2 The OD value of antibodies in each group

2.4 小鼠腎臟病理改變

首次免疫后9周,處死小鼠,留取右側(cè)腎臟做病理切片HE染色。hCDR1免疫組小鼠腎臟以腎小球增生,間質(zhì)炎性細胞浸潤為主,未見明顯的細胞新月體形成及腎小球硬化,部分腎小管中可見少量嗜伊紅的蛋白樣物質(zhì)沉積。SLE-cGVHD組小鼠腎臟以腎小球硬化為主,可見細胞新月體形成,腎小管大量嗜伊紅蛋白樣物質(zhì)沉積(見圖3)。小鼠腎臟冰凍切片直接免疫熒光結果顯示，hCDR1免疫小鼠及SLE-cGVHD小鼠腎臟出現(xiàn)顆粒狀熒光物質(zhì)沿腎小球基底膜沉積,hCDR1免疫組小鼠腎臟熒光強度顯著弱于陽性對照(SLE-cGVHD)組小鼠,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4,表2)。

3 討論

hCDR1是基于人dsDNA抗體分子互補決定區(qū)設計合成的一段含有19個氨基酸的多肽,研究表明hCDR1可誘導狼瘡小鼠產(chǎn)生免疫耐受,減緩疾病進展[2-5]。目前而言,hCDR1是否會作為致病源誘發(fā)或加重狼瘡病變尚未可知。本研究將hCDR1輔以免疫佐劑皮下免疫B6D2F1小鼠,小鼠出現(xiàn)與SLE-cGVHD相似的病理改變,證實hCDR1具有免疫原性,可以作為致病原誘發(fā)B6D2F1小鼠出現(xiàn)狼瘡樣病變。

A.陰性對照組 B.hCDR1免疫組 C.陽性對照組圖3 各組小鼠腎臟病理改變HE染色 (×400)Figure 3 Pathological changes of kidney by HE staining (×400)

A.陰性對照組 B.hCDR1免疫組 C.陽性對照組圖4 各組小鼠腎臟免疫復合物沉積直接免疫熒光結果 (×200)Figure 4 Immunofluorescence results of kidney sections stained with FITC-conjugated IgG antibody (×200)

表2 各組小鼠腎臟熒光強度的分布情況對比

Table 2 IgG deposition scores of kidney sections

組別-±++++++++++陰性對照80000020μg組800000100μg組201410500μg組202310陽性對照000323

hCDR1 100 μg,500 μg組,陽性對照組與陰性對照相比較均P<0.05;hCDR1免疫組與陽性對照組比較,P<0.05

以dsDNA抗體為代表的多種自身抗體是SLE最主要特征之一,也是SLE診斷的標準之一[1]。本研究表明,hCDR1免疫小鼠血清中除了hCDR1抗體外,還檢測出了抗dsDNA、組蛋白等狼瘡特異性抗體。SLE可累計全身各個系統(tǒng),其中腎臟是最常被累及的器官[1,9]。尿蛋白陽性是腎臟受累的主要表現(xiàn),也是檢驗狼瘡模型成功與否的標準之一。在hCDR1免疫后第9周,75% 100 μg hCDR1免疫的小鼠及62.5% 500 μg hCDR1免疫的小鼠出現(xiàn)了蛋白尿。腎臟HE及直接免疫熒光染色顯示,hCDR1免疫小鼠呈現(xiàn)出與經(jīng)典狼瘡模型SLE-cGVHD相似的腎臟病理改變。SLE血液系統(tǒng)受累表現(xiàn)為外周血紅細胞、血小板和白細胞同時或單獨的降低[1]。本次研究中,SLE-cGVHD小鼠及hCDR1免疫小鼠血液系統(tǒng)表現(xiàn)為血小板數(shù)量的下降以及白細胞的增加。抗dsDNA抗體、抗組蛋白抗體等狼瘡特異性抗體的出現(xiàn),腎臟及血液系統(tǒng)的受累,表明作為耐受肽的hCDR1誘發(fā)B6D2F1小鼠出現(xiàn)狼瘡樣病理改變。

表位擴展(epitope spreading)是指機體在免疫應答的過程中由針對某抗原分子的一個表位到多個表位,從某種抗原到其他抗原的逐漸多樣化的現(xiàn)象。近年來研究表明,人或者動物的免疫應答過程中均存在表位擴展,并且參與了自身免疫性疾病的發(fā)病過程[10-12]。研究顯示Sm抗原模擬表位肽免疫小鼠,可以誘導出狼瘡樣改變[13,14]。本次研究hCDR1皮下免疫小鼠,小鼠血清除了hCDR1抗體之外還檢測到抗dsDNA、組蛋白等多種自身抗體。這表明小鼠在對hCDR1發(fā)生免疫應答的過程中發(fā)生表位擴展,由針對hCDR1的免疫反應發(fā)展為針對dsDNA,組蛋白等多種自身抗原的免疫反應。對于這種現(xiàn)象發(fā)生的機制及在hCDR1誘發(fā)小鼠狼瘡樣病變中所起的作用尚需進一步研究和探討。SLE可累計全身各個系統(tǒng),其中腎臟是最常被累及的器官。研究表明以抗dsDNA抗體為代表的多種自身抗體在狼瘡患者腎臟的發(fā)病過程中起到重要作用[15,16]。hCDR1免疫小鼠的腎臟損傷是否與外周血中出現(xiàn)的抗dsDNA等自身抗體相關尚需進一步的探究。

相較于非特異性免疫抑制治療,通過hCDR1等表位肽誘導免疫耐受治療SLE的同時不會對機體進行全面的免疫抑制,因而具有很好的應用前景。然而,本研究證實,作為耐受肽的hCDR1同樣具有致病性可誘發(fā)小鼠出現(xiàn)狼瘡樣病變。這也提示今后應用hCDR1誘導免疫耐受,治療狼瘡發(fā)病過程的時候需注意干預途徑及劑量,警惕hCDR1作為致病原誘發(fā)或加重疾病的可能性。

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Tolerizing peptide hCDR1 induces lupus-like symptom in mice

SUN Yushi,YANG Fei,BAO Lingyu,WANG Yue,ZHAO Fengyi,JIAO Xiang,YANG Jing,SHI Bingyin*

(DepartmentofEndocrinology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;*Correspondingauthor,E-mail:shibingy@126.com)

ObjectiveTo explore the possibility of hCDR1,a peptide based on the complementarity determining region(CDR)1 of a human monoclonal anti-DNA autoantibody,inducing an SLE-like disease in B6D2F1 mice.MethodsForty B6D2F1 mice were divided into five groups randomly:hCDR1 20 μg group,100 μg group,500 μg group,normal control group and positive control group[chronic graft versus host disease murine model of lupus(SLE-cGVHD)].Mice were subcutaneously injected with 0.2 ml hCDR1 in hCDR1 groups and 0.2 ml adjuvant in normal control group.SLE-cGVHD was induced by intravenous injections of parental female DBA/2 lymphocytes. The serum hCDR1 antibody, anti-dsDNA antibody,anti-histone antibody and total IgG were detected by ELISA.Kidney spe-cimens were observed by immunofluorescence and histological examination.ResultsSLE-like symptoms were successfully induced by hCDR1 in 100 μg group and 500 μg group.Compared with normal control group,mice in 100 μg group and 500 μg group acquired higher OD value of dsDNA antibodies(P<0.05)and anti-histone antibodies(P<0.05).Compared with normal control group,periphe-ral blood PLT significantly decreased,while peripheral blood WBC increased in 100 μg group and 500 μg group(P<0.05).In 100 μg group and 500 μg group,75% mice got nephritis characterized by proteinuria and immunocomplex deposition in glomeruli.No SLE-like symptom was detected in 20 μg hCDR1 immunized mice and normal control mice.ConclusionSLE-like symptom could be induced by hCDR1 in B6D2F1 mice.

systemic lupus erythematosus； tolerizing peptide； chronic graft versus host disease； adoptive immunity； mice； hCDR1

國家自然科學基金資助項目(81471005)

孫玉石，女，1988-10生，在讀博士，E-mail:395755862@qq.com

2016-12-12

R593.2

A

1007-6611(2017)03-0235-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.008