西格列汀對2型糖尿病大鼠胰島β細胞PDX-1 mRNA表達的影響

鄭坤杰，武 革，耿建林，吳美芬，方 爍

(1河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院內分泌科，衡水 053000；2廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內分泌科；*通訊作者，E-mail：wuge427427@126.com)

西格列汀對2型糖尿病大鼠胰島β細胞PDX-1 mRNA表達的影響

鄭坤杰1，武 革2*，耿建林1，吳美芬2，方 爍2

(1河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院內分泌科，衡水 053000；2廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內分泌科；*通訊作者，E-mail：wuge427427@126.com)

目的 觀察西格列汀對2型糖尿病大鼠糖脂代謝及胰島β細胞胰腺十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)mRNA表達水平的影響。 方法 將60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組及西格列汀組。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病模型組與西格列汀組給予高脂飼料喂養(yǎng)，于第8周末以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)30 mg/kg腹腔注射，成模后西格列汀組給予西格列汀100 mg/kg灌胃，每日1次，共持續(xù)4周。其余兩組予等量的生理鹽水灌胃。HE染色觀察胰島細胞組織學改變，以實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測大鼠胰腺胰島細胞PDX-1mRNA的表達。 結果 與正常對照組比較，治療前模型組及西格列汀組空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)增高，胰島素敏感指數(shù)(ISI)、PDX-1 mRNA的表達量明顯減低(P<0.01)。與治療前比較，西格列汀治療后2型糖尿病大鼠FBG、FINS、TG、TC下降(P<0.01)，ISI明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，西格列汀組胰腺PDX-1 mRNA的表達量可明顯增高(P<0.01)。 結論 西格列汀可上調2型糖尿病大鼠胰島β細胞PDX-1基因的表達。

西格列汀； 糖尿??； 胰島β細胞； 胰腺十二指腸同源盒-1； 大鼠

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種腸肽類激素，其作用的多效性在糖尿病治療領域已顯示了廣闊應用前景。西格列汀是二肽基肽酶-4(dipeptidylpeptidase-4,DPP-4)抑制劑，主要通過選擇性抑制DDP-4的活性，從而延長GLP-1的作用。GLP-1增加β細胞數(shù)量的作用被視為其重要的β細胞保護效應，有研究顯示，GLP-1的這一作用是依賴于PDX-1基因的正常表達。PDX-1是β細胞內重要的轉錄因子，參與β細胞胰島素基因的轉錄調控，從而實現(xiàn)β細胞再生和修復。本實驗通過建立T2DM大鼠模型，觀察西格列汀對T2DM大鼠胰腺PDX-1基因表達水平的影響，探討其對胰島β細胞增殖與再生的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周近交系雄性SD大鼠60只(SPF級)，體質量(200±20)g，購自廣東醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2008-0008。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司，real-time PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司，反轉錄試劑盒購自美國Promega公司，西格列汀購自默沙東公司，血糖儀及血糖檢測試紙條購自德國羅氏公司,PCR儀購于德國Biometra公司。

1.3 動物模型的建立

雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為：正常對照組、糖尿病模型組、西格列汀組，每組20只。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余兩組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周。實驗組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg，正常對照組注射同等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。實驗組72 h后測隨機尾靜脈血糖。以兩次隨機血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，然后西格列汀組給予西格列汀100 mg/kg灌胃，每日1次；正常對照組和模型組則給予相同體積生理鹽水灌胃。

1.4 糖脂代謝指標測定

用全自動生化分析儀檢測血清空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)，ELISA法檢測血清胰島素(INS)。ISI=Ln[1/FBG·FINS]。

1.5 胰島細胞組織學觀察

將固定于10%甲醛中的胰島脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片。將切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，伊紅染色，蘇木精復染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片。光鏡下觀察，進行病理學分析。

1.6 Real-Time RT-PCR法檢測胰腺組織PDX-1 mRNA

Trizol一步法提取總RNA。取2 μg mRNA逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增(反應條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s，40個循環(huán)，62 ℃ 30 s收集熒光信號)；融解曲線分析：溫度60-95 ℃。PDX-1 mRNA的引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，上游引物：5′-GCGAGATGCTGGCAGACC TCT-3′，下游引物：5′-GGCAGACCTGGCGGTTCACAT-3′,片段長度94 bp;以18sRNA為內參，上游引物：5′-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA-3′，下游引物：5′-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3′，片段長度108 bp;PCR反應條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s，40個循環(huán)，62 ℃ 30 s收集熒光信號；融解曲線分析：溫度60-95 ℃。DNA擴增儀自動分析并計算結果。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。定量資料組內數(shù)據(jù)比較采用配對t檢驗，組間數(shù)據(jù)比較采用onewayANOVA分析及q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖、血脂及相關指標情況

與正常對照組比較，糖尿病模型組及西格列汀組FBG、FINS、TG、TC明顯升高(P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.01)。西格列汀組治療后與治療前及糖尿病模型組比較，F(xiàn)BG、FINS、TG、TC明顯降低(P<0.01)，ISI明顯升高(P<0.01)；而模型組FBG、FINS、TG、TC較治療前明顯升高(P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.01，見表1，2)。

組別nFBG(mmol/l)FINS(mU/L)ISI治療前治療后治療前治療后治療前治療后正常對照組205．13±0．645．32±0．79 15．14±1．3515．40±1．22 -4．34±0．21-4．39±0．23 模型組2014．17±0．72?16．81±2．05?△30．06±1．50?30．59±1．64?-6．04±0．09?-6．21±0．16?西格列汀組2014．40±0．94?8．99±1．61?#△30．14±1．48?27．55±1．25?#△-6．07±0．09?-5．60±0．22?#△ F197．24861．316310．906285．950477．007175．017 P0．0000．0000．0000．0000．0000．000

與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與治療前比較,△P<0.05

組別nTGTC治療前治療后治療前治療后正常對照組200．79±0．080．82±0．101．45±0．251．53±0．20模型組201．73±0．11?2．02±0．22?1．97±0．24?2．41±0．29?西格列汀組201．76±0．12?1．24±0．22?#△202±035?166±037?#△ F23045787447999013967 P0000000000010000

與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與治療前比較,△P<0.05

2.2 西格列汀對大鼠胰腺組織的影響

正常對照組大鼠胰腺組織HE染色，胰島呈圓形或卵圓形，分布均勻、形狀規(guī)則、界限清楚，胰島細胞數(shù)量多。模型組胰島體積變小，分布彌散，部分胰島排列、形狀不規(guī)則，結構不清，胰島細胞數(shù)量減少，部分可見細胞核固縮。西格列汀組胰島形狀偶可見不規(guī)則，界限稍模糊，胰島細胞數(shù)量較模型組增多(見圖1)。

A.正常對照組 B.模型組 C.西格列汀組圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色 (×200)Figure 1 HE dying of pancreatic tissues in three groups (×200)

2.3 大鼠胰腺組織PDX-1 mRNA的表達

與正常對照組比較，模型組和西格列汀組PDX-1 mRNA的表達量均降低(P<0.01)，西格列汀組治療后PDX-1 mRNA的表達量明顯增高,與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

組別nPDX?1mRNA正常對照組204．23±0．24模型組201．00±0．05?西格列汀組202．88±0．13?#

經(jīng)one-way ANOVA分析,F=1 069.57,P=0.000;與正常對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3 討論

人類PDX-1在出生及成年后呈特異性表達于90%的β細胞和少量的(10%)δ細胞。近年來，由于PDX-1基因在胰島素分泌過程中不可缺少，PDX-1在胰腺發(fā)育、分化、再生及胰島素分泌過程中的作用受到關注[1-3]。因此，越來越多的研究致力于利用PDX-1在β細胞分化發(fā)育中的關鍵作用，將胚胎干細胞、成體肝細胞或胰腺導管上皮細胞等非胰島素分泌細胞誘導分化成為具有分泌胰島素功能的細胞[4]。Lee等[5]用編碼小鼠PDX-1基因的重組腺病毒轉染人類脂肪組織源性干細胞(human adipose tissue-derived stem cells,hASCs)，并將hASCs在高糖環(huán)境下分化，結果發(fā)現(xiàn)，過表達外源性的PDX-1能明顯增加胰島素基因的轉錄以及胰腺發(fā)育所必需的關鍵的轉錄因子如FoxA2、NKx2.2和NeuroD的表達。但長期高血糖、脂代謝紊亂可以損傷PDX-1基因,使PDX-l表達下調,使胰島素的分泌減少，導致β細胞功能逐漸衰退,進而加重了糖脂代謝紊亂。在本實驗中觀察到,T2DM模型組大鼠FBG、TG、TC較正常對照組明顯增高，PDX-1 mRNA表達下降，胰島β細胞數(shù)量減少，表明糖脂毒性對T2DM大鼠胰島β細胞具有損傷作用，導致胰島細胞數(shù)量減少，而T2DM大鼠胰腺PDX-1表達的減少，可能正是T2DM大鼠胰島β細胞功能減弱的重要原因。

已有研究表明，DPP-4抑制劑西格列汀可以通過提高GLP-1水平，降低胰高血糖素，降低肝臟及腸道內載TG脂蛋白的水平來影響TG水平以及改善血糖[6，7]。本實驗結果亦顯示，西格列汀組使用西格列汀干預后其血糖明顯下降，其大鼠胰島細胞數(shù)量較模型組增多，且胰腺胰島β細胞PDX-1 mRNA的表達增多。上述結果表明西格列汀對胰島胰島β細胞的保護作用可能與其上調PDX-1有關，但具體機制尚不明確，有研究顯示，GLP-1類似物Exendin-4誘導的胰島素分泌細胞和胰島細胞在形態(tài)學上類似，在脂肪間充質干細胞的培養(yǎng)液中加入Exendin-4，PDX-1及胰島素基因的表達明顯增多，胰島素陽性細胞的比例增加了4倍，胰島素分泌量亦增加了2.5倍。說明Exendin-4可通過增加PDX-1基因的表達來促進脂肪間充質干細胞向胰島素分泌細胞轉化[8]。Pugazhenthi等[9]發(fā)現(xiàn)DDP-4抑制劑阿格列汀可明顯增加2型糖尿病大鼠胰島β細胞胰島素和PDX-1水平，且β細胞存活率亦明顯增加。上述研究均證明了西格列汀可直接或間接調控PDX-1基因的表達，從而增加INS基因的轉錄，降低血糖。研究還發(fā)現(xiàn)，DPP-4抑制劑可增加β細胞分化和增殖，增強胰島體系結構重塑并保持胰島功能[10]。本研究表明，西格列汀對糖脂代謝紊亂起著正向作用，并可增加胰島β細胞PDX-1 mRNA的表達，并一定程度地改善胰島β細胞功能。

[1] 汪珊珊,陳明衛(wèi). PDX-1基因克隆載體的體外構建[J]. 山東醫(yī)藥,2016,56 (4):31-33.

[2] 白國立,史光軍. PDX-1基因提高脂肪間充質干細胞分化為胰島分泌細胞能力的研究前景[J]. 臨床普外科電子雜志,2014,2(4):45-49.

[3] Fujimoto K.Kenneth S. Pdx1 and other factors that regulate pan-creatic β-cell survival[J]. Diabetes Obes Metab,2009,11(4):30-37.

[4] Semache M,Ghislain J,Zarrouki B,etal.Pancreat-ic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regu-lated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines[J]. Islets,2014,6(4):982-376.

[5] Lee J,Kim SC,Kim SJ,etal. Differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into aggregate of insulin-producing cells through overexpression of pancreatic and duodenal homeobox gene-1[J].Cell Transplantation,2013,22(6):1053-1060.

[6] Xiao C,Dash S,Morgantini C,etal. Sitagliptin,a dipeptidyl pepti-dase-4 inhibitor，acutely inhibits intestinal lipoprotein particle se-cretion in healthy humans[J]. Diabetes,2014,63(7):2394-2401.

[7] Derosa G,Carbone A,D’Angelo A,etal. A randomized,double-blind,placebo-controlled trial evaluating sitagliptin action on insulin resistance parameters and β-cell function[J]. Expert Opin Pharmacother,2012,13(17):2433-2442.

[8] Khorsandi L,Saremy S,Khodadadi A,etal.Effects of exendine-4 on the differentiation of insulin producing cells from rat adipose-derived mesenchymal stem cells[J].Cell J,2016,17(4):720-729.

[9] Pugazhenthi S,Qin L,Bouchard R,etal.Dipeptidyl peptidase-4 inhibition in diabetic rats leads to activation of the transcription factor CREB in β-cells[J].Eur J Pharmacol,2015,755:42-49.

[10] Zhang X,Wang Z,Huang Y,etal.Effects of chronic administration of alogliptin on the development of diabetes and beta-cell function in high fat diet/streptozotocin diabeticmice[J]. Diabetes Obes Metab,2011,13(4):337-347.

Effect of sitagliptin on the expression of PDX-1 mRNA in islet beta cells of type 2 diabetes rats

ZHENG Kunjie1,WU Ge2*,GENG Jianlin1,WU Meifen2,FANG Shuo2

(1DepartmentofEndocrinology,HarrisonInternationalPeaceHospitalofHengshuiCity,Hengshui053000，China；2DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:wuge427427@126.com)

ObjectiveTo explore the influence of sitagliptin on the glucose and lipid metabolism and the expression level of pancreatic duodenal homeobox-1(PDX-1)mRNA in type 2 diabetes rats.MethodsSixty SD rats were randomly divided into normal control group,T2DM group and sitagliptin group.The rats were given normal diet in normal control group.The rats were given high fat diet in T2DM group and sitagliptin group,and the rats were intraperitoneally injected with streptozotocin(STZ)30 mg/kg at the end of 8 weeks. The rats in sitagliptin group were treated with daily intragastric sitagliptin(100 mg/kg)for 4 weeks after the modeling.Hematoxylin and Eosin staining was used to observe the histological changes of islet cells.Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(real-time RT-PCR)was used to detect the expression of PDX-1 mRNA in pancreatic islet cells.ResultsBefore treatment,the levels of FBG,FINS,TG and TC in sitagliptin group and T2DM group were significantly higher than in normal control group(P<0.01),while the level of ISI and the expression of PDX-1 mRNA were significantly lower.After treatment,the levels of FBG,FINS,TG,TC in sitagliptin group were decreased(P<0.01)，while the level of ISI was significantly increased(P<0.01).The expression of PDX-1 mRNA in sitagliptin group was significantly higher than in T2DM group(P<0.01).ConclusionSitagliptin can upregulate the expression of PDX-1 mRNA.

sitagliptin； diabetes mellitus； islet beta cells； PDX-1； rats

廣東省科技計劃資助項目(2011B031800231)

鄭坤杰，女，1986-02生，碩士，住院醫(yī)師，E-mail:w820lxy@sohu.com

2016-10-26

R587.1

A

1007-6611(2017)03-0231-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.007