表達PEDF的人胎盤間充質干細胞抑制人臍靜脈內皮細胞增殖和遷移

陳巧玲，白亦光，肖東琴，劉 康，馮 剛*

(1川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院腫瘤分院，南充 637000；2川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院骨科；3川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所；*通訊作者，E-mail：lssmd18@gmail.com)

表達PEDF的人胎盤間充質干細胞抑制人臍靜脈內皮細胞增殖和遷移

陳巧玲1，白亦光2，肖東琴3，劉 康3，馮 剛3*

(1川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院腫瘤分院，南充 637000；2川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院骨科；3川北醫學院第二臨床醫學院，南充市中心醫院組織工程與干細胞研究所；*通訊作者，E-mail：lssmd18@gmail.com)

目的 探討攜帶色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)基因的腺病毒轉染胎盤間充質干細胞(PMSCs)后對人臍靜脈內皮細胞增殖和遷移的抑制作用。 方法 取足月產胎兒的胎盤組織，分離、培養PMSCs，用流式細胞術鑒定其表面標記。用攜帶PEDF基因的腺病毒(Ad-PEDF)轉染PMSCs，并用Western blot和ELISA檢測轉染了Ad-PEDF的PMSCs細胞(PMSCs-PEDF)培養上清中PEDF的表達。MTT測定PMSCs-PEDF表達的PEDF對HUVECs增殖的影響。Transwell實驗檢測PMSCs-PEDF所表達的PEDF蛋白對HUVECs遷移的抑制作用。 結果 用流式細胞術對分離的PMSCs進行免疫表型分析，結果顯示，CD44、CD73、CD90、CD105表達呈陽性，而CD34、CD45表達呈陰性。Western blot結果顯示，重組腺病毒成功將PEDF基因傳送至PMSCs細胞內并產生分泌性的PEDF蛋白。ELISA結果顯示PMSCs-PEDF可并分泌高水平的PEDF至培養基中[(65.2±4.9)ng/ml]。MTT結果顯示，PMSCs-PEDF培養基上清在稀釋比例為1 ∶2時對HUVECs抑制率為56.3%±8.7%，隨著稀釋比例的增加抑制率逐漸降低。而PMSCs及PMSCs-null的培養基上清則對HUVECs抑制作用很弱。Transwell實驗結果顯示，與PMSCs組(208.8±14.7)及PMSCs-null組(199.0±20.7)相比，PMSCs-PEDF組(79.4±14.5)可顯著抑制HUVECs遷移(均P<0.05)。 結論 PMSCs-PEDF可在體外高效表達PEDF蛋白，并抑制HUVECs細胞的增殖和遷移。

色素上皮衍生因子； 胎盤間充質干細胞； 人臍靜脈內皮細胞； 細胞增殖； 細胞遷移

在原發實體瘤的生長和轉移過程中，血管生成擔任了非常重要的角色[1]。色素上皮衍生因子(PEDF)是一種50 kD的分泌型糖蛋白，被認為是最有潛力的內源性抗血管生成因子。PEDF可以通過誘導血管內皮細胞凋亡以及抑制血管內皮細胞增殖和遷移發揮其抗血管生成作用，甚至在VEGF存在的情況下，也可發揮作用。研究表明，純化的PEDF蛋白，或攜帶PEDF基因的病毒和非病毒載體已被證實對包括肺癌、肝癌、結腸癌在內的多種腫瘤有效[2-4]。但是較短的半衰期以及較大的毒副作用限制了這些方法的應用[2,3]。

間充質干細胞(MSCs)是一種具有多向分化潛能的細胞，可向成骨細胞、成軟骨細胞及成脂細胞轉化。MSCs可以作為一種新型、高效的治療工具用于靶向傳送以及在腫瘤局部生產具有生物活性的藥物[5,6]。目前應用最廣泛的間充質干細胞來源是骨髓。但從骨髓中提取細胞只能通過侵入性操作獲得，并且隨著年齡的增長，骨髓中的間充質干細胞數量也會隨之下降。許多研究指出，胎盤來源的MSCs(PMSCs)與骨髓來源的MSCs在細胞特性以及多向分化潛能方面都極其相似。而且，胎盤組織還滿足了兩個迫切需要解決條件：可獲得足夠多的間充質干細胞，并且使用無創的收集方法。并且由于胎盤來源的多潛能干細胞處于胚胎發育早期的細胞，它們比成人骨髓MSCs具有更低的免疫原性。這些特性使PMSCs可作為一種非常有潛力的基因載體用于腫瘤的治療研究[7-9]。

本研究以PMSCs作為基因治療的靶向運載工具，將攜帶有PEDF基因腺病毒轉染PMSCs(PMSCs-PEDF)，觀察PEDF表達情況，以及外源性PEDF對臍靜脈內皮細胞體外增殖、遷移的影響，探討PMSCs作為抗腫瘤基因治療載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞株和載體

人臍靜脈內皮細胞購自中國科學院上海細胞庫。細胞培養使用DMEM培養基(DMEM;Gibco BRL，Grand Island，USA)加入10%胎牛血清(FBS，Gibco，Auckland，NZ)，2 mmol/L鏈霉素和100 μg/ml阿米卡星。PEDF重組腺病毒載體(Ad-PEDF)由四川大學魏于全教授惠贈。

1.2 主要試劑和儀器

小鼠抗人PEDF單克隆抗體(R&D Systems，USA)，人PEDF蛋白ELISA試劑盒(GBD，USA)，MTT溶液(Sigma，USA)，DMSO溶液(Sigma，USA)。流式細胞儀(BD Biosciences，USA)。超濾器(10 kD，Millipore，USA)，Transwell小室(Millipore，USA)。

1.3 分離、擴增人的胎盤間充質干細胞

取足月經陰道產或經剖腹產的胎兒的胎盤(根據醫院的規定并取得家屬同意)。剝除母體蛻膜，然后切開胎盤排出其中的臍帶血。剪碎胎盤后研磨并用0.1%Ⅳ型膠原酶消化，在勻漿中加入含有10%的胎牛血清的低糖DMEM培養基(含2 mmol/L鏈霉素和100 μg/ml阿米卡星)，再將培養瓶置入含有5%CO2氣體的37 ℃孵育箱中培養。48 h后，不貼壁的造血細胞被棄去，而貼壁的MSCs被留下來進一步擴增。每周更換培養基兩次。第5-8代PMSCs被用于實驗。用流式細胞儀通過檢測CD34、CD44、CD45、CD73、CD90和CD105等分子標記來分析PMSCs的表型特征[8]。

1.4 腺病毒轉染PDMSCs

用HEK293細胞來擴增腺病毒，并用梯度CsCl按照標準方法來純化腺病毒[10]。當PMSCs傳代細胞匯合度達90%以上時，設感染復數(MOI)為1 500加入適量Ad-PEDF重組腺病毒，搖勻后置于37 ℃、5%CO2、95%濕度下的恒溫培養箱培養，4 h后更換為無血清低糖DMEM培養基。同時，用未轉染病毒的PMSCs及空載腺病毒轉染PMSCs(PMSCs-null)作為對照。

1.5 Western blot分析和ELISA實驗檢測PEDF的表達

用腺病毒轉染PDMSCs 4 h，將含病毒的培養基更換為無血清低糖DMEM培養基。繼續放入細胞培養箱孵育48 h后收集條件培養基(CM)。用超濾器濃縮條件培養基，然后用Western blot來檢測培養基中是否含有PEDF，用小鼠抗人PEDF單克隆抗體作為一抗。用檢測人PEDF蛋白的ELISA試劑盒來檢測條件培養基中分泌的PEDF濃度。

1.6 HUVECs遷移抑制實驗

Transwell遷移試驗用來明確Ad-PEDF轉染的PMSCs對HUVECs的遷移的影響。HUVECs(每孔2×104)以200 μl的條件培養基重懸，條件培養基分別來源于PMSCs、PMSC-null和PMSC-PEDF培養基上清。在Transwell小室上層底部用50 μl的基質膠覆蓋，然后將HUVECs細胞懸液加入小室的上層。在小室的下層加入600 μl包含多種生長因子的EBM-2培養基。將Transwell小室放入細胞培養箱孵育24 h之后，未遷移的細胞被除去。而遷移到膜的另一面的細胞用100%甲醇固定，并用0.05%的結晶紫染色，用載玻片封片后，置于光學顯微鏡下計數100倍下5個視野。

1.7 HUVECs增殖抑制實驗

采用MTT法，檢測PMSCs-PEDF培養基上清中的PEDF蛋白對HUVECs增殖的影響。主要操作步驟：將HUVECs細胞懸液按2×103個/孔接種于96孔板，每孔體積100 μl。置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養過夜。待細胞貼壁后分別加入PMSCs、PMSCs-null、PMSCs-PEDF培養基上清100 μl，另有一組加入DMEM培養基100 μl作為陰性對照，每組設置4個復孔，繼續培養72 h。每孔加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，繼續培養4 h，棄去上清液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，490 nm波長測定各孔光吸收值，以不含細胞的等體積培養基作為空白對照。得到數值后按如下公式進行計算：細胞生長抑制率(%)=[1-(OD試驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%。

1.8 統計學分析

實驗數據采用均數±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件來進行數據處理和統計學分析。多組資料之間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間用t檢驗進行處理。P<0.05可認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PMSCs的分離、培養和鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察，PMSCs形態為典型成纖維細胞樣，以長梭形為主，大量細胞呈渦旋狀生長(見圖1)。MSCs缺乏特異性的表面標志物，通常認為MSCs陽性表達CD44、CD73、CD90、CD105等表面分子，而不表達CD34、CD45等造血干細胞、內皮細胞表面表達的分子。用流式細胞術檢測第3代PMSCs上的表面標志物，結果顯示CD44、CD73、CD90、CD105均呈陽性表達，而造血干細胞、內皮細胞表達的CD34、CD45則呈陰性表達(見圖2)，與文獻報道一致。證明本實驗所分離的細胞為間充質干細胞。

圖1 人胎盤間充質干細胞形態學Figure 1 Morphology of human placenta mesenchymal stem cells

圖2 流式細胞術分析PMSCs表面標志物Figure 2 Analysis of the PMSCs markers by flow cytometry

2.2 檢測PMSCs-PEDF對PEDF蛋白表達的影響

當PMSCs培養達到大約90%細胞融合時，用MOI(感染復數)為1 500的腺病毒共培養4 h，然后更換為無血清低糖DMEM培養基。繼續孵育48 h后，將PMSCs培養基上清中分泌的PEDF的量用Western blot和ELISA檢測。Western blot結果顯示：從PMSCs-PEDF的培養上清液中可見到明顯的PEDF蛋白條帶，而PMSCs-null組和未轉染的PMSCs組上清液中則未見條帶顯示，證明PDMSCs-PEDF可成功表達PEDF并分泌至培養基中(見圖3)。ELISA結果顯示分泌至培養基中的PEDF濃度為(65.2±4.9)ng/ml，而其余兩組中PEDF含量極低，幾乎不能檢測出(見圖4)。

2.3 PMSCs-PEDF抑制臍靜脈內皮細胞的遷移和增殖

光鏡觀察(×100)顯示，PMSCs-PEDF組每視野下發生遷移的細胞數為79.4±14.5個，而PMSCs組為208.8±14.7個、PMSCs-null組為199.0±20.7個，差異有統計學意義(P<0.05,見圖5A，B)。以上結果說明PMSCs-PEDF組的培養上清顯著抑制了臍靜脈內皮細胞的遷移，而PMSCs-null組和PMSCs

組的培養上清對臍靜脈內皮細胞的遷移則無明顯抑制作用。

圖3 Western blot檢測PMSCs-PEDF分泌的PEDFFigure 3 Expression of PEDF secreted by PMSCs-PEDF by Western blot

圖4 ELISA檢測PMSCs-PEDF培養基中的PEDF濃度Figure 4 PEDF concentration in the medium derived from PMSCs-PEDF by ELISA

圖5 PMSCs-PEDF體外抑制臍靜脈內皮細胞遷移及增殖的作用 (×100)Figure 5 Effect of PMSCs-PEDF on the HUVECs migration and proliferation in vitro (×100)

通過MTT法檢測PMSCs-PEDF分泌的色素上皮衍生因子蛋白對人HUVECs的增殖抑制情況，以PMSCs及PMSCs-null的培養上清作為對照組。結果顯示，PMSCs-PEDF培養基上清在稀釋比例為1 ∶2時對HUVECs抑制率為56.3%±8.7%，隨著稀釋比例的增加抑制率逐漸降低，說明抑制率與濃度呈劑量依賴效應。相反，PMSCs及PMSCs-null的培養基上清則對HUVECs抑制作用很弱(P<0.05，見圖5C)。以上實驗結果表明，攜帶PEDF基因的腺病毒轉染PMSCs后，PMSCs-PEDF所分泌的PEDF蛋白具有抗血管生成的生物活性。

3 討論

血管形成在腫瘤生長及轉移過程中起著至關重要的作用[1]。PEDF作為最有效的天然抗血管生成因子，其抗血管生成作用在多種腫瘤中已被證實。PEDF可通過激活Fas/FasL凋亡途徑誘導內皮細胞死亡，并調節促血管生成和抗血管生成因子之間的平衡，抑制血管生成刺激因子引起的血管內皮細胞的增殖和移動，從而間接抑制腫瘤生長[2]。本實驗也證實，含有PEDF的PMSCs-PEDF培養基上清可抑制HUVECs的成管、遷移及增殖。除此之外，它還具有促進腫瘤細胞凋亡及誘導腫瘤細胞分化成熟等直接抗腫瘤作用。此前大量的研究顯示，攜帶PEDF基因的腺病毒在黑色素瘤、肺癌等多種腫瘤中表現出明顯的抑瘤效果[4]。但由于腺病毒載體的高免疫源性，易在體內產生中和抗體而迅速被清除，使其很難在瘤體中達到有效濃度，而單純通過增大腺病毒的劑量來提高治療濃度則可能發生嚴重的副反應。因此需要更加安全有效的基因運載工具。

間充質干細胞是一種來源于中胚層的非造血干細胞，除干細胞所具有的增殖、自我更新、分化能力外，其還具有低免疫原性和腫瘤趨向性[5]。人們通過細胞工程技術將其改造成為各種抗瘤成分的載體，使其攜帶抗癌因子、溶瘤病毒、抗瘤藥物納米微粒、抗癌藥物前體轉化因子等成分，在其注入實驗體后遷移至腫瘤原發灶或者轉移灶釋放目的成分，進而抑制腫瘤的生長[6]。骨髓、脂肪組織等途徑均可獲取間充質干細胞，兩種方法獲取的細胞數量較少，且與供者的身體狀況、身體機能、年齡等相關，并且從骨髓中獲取干細胞給提供者帶來較大的痛苦。作為一種替代來源，胎盤間充質干細胞具有多方面的優勢：胎盤可以在每次生產中獲得并且它的使用不會構成任何道德問題，因此來源非常廣泛。并且與骨髓捐獻相比，供者無痛苦，污染機會少。PMSCs較骨髓MSCs增殖迅速，且有更強的長期增殖能力[7-9]。

本實驗從胎盤組織中成功分離及培養得到了足量的可穩定傳代的PMSCs，并通過流式細胞術對細胞表面標記的分析，證實該細胞為間充質干細胞。用攜帶PEDF基因的腺病毒轉染PMSCs后，從PMSCs-PEDF培養基中檢測到了較高濃度的PEDF蛋白表達，而在PMSCs及PMSCs組中，PEDF的表達量幾乎檢測不出。說明已將目的基因成功地轉染入PMSCs中，使其能夠穩定產生PEDF并分泌至細胞外。PMSCs-PEDF的培養基上清可抑制人的臍靜脈內皮細胞的成管、遷移及增殖，而對照組則無此作用，表明其分泌的PEDF蛋白具有生物活性。

因此，本實驗證實，PMSCs可作為一種高效的基因載體應用于腫瘤的治療。但仍需要進一步的研究來探討其在體內對腫瘤的靶向性，在體內對目的基因的穩定表達程度，并觀察其安全性。

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PEDF expressed by human placenta mesenchymal stem cells inhibits human umbilical vein endothelial cell proliferation and migration

CHEN Qiaoling1,BAI Yiguang2,XIAO Dongqin3,LIU Kang3,FENG Gang3*

(1DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China;2OrthopedicDepartment,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;3ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCell,NanchongCentralHospital,SecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:lssmd18@gmail.com)

ObjectiveTo explore the inhibitive effect of human placenta mesenchymal stem cells(PMSCs)transfected by recombinant adenoviruses loaded with pigment epithelium-derived factor(PEDF)gene on the human umbilical vein endothelial cell(HUVECs)proliferation and migration.MethodsPMSCs were isolated from full-term pregnancy human placenta by the method of enzyme digestion.The cells were culturedinvitro.The phenotype characteristics of PMSCs were analyzed by flow cytometry.The PMSCs were transfected with recombinant adenovirus-loaded PEDF gene(Ad-PEDF),and then the expression of PEDF was detected by Western blot and ELISA.MTT assay was performed to observe the inhibitive effect of PMSCs-PEDF on HUVECs proliferation,and Transwell assay was used to determine the inhibitive effect of PEDF expressed by Ad-PEDF-infected PMSCs(PMSCs-PEDF)on HUVECs.ResultsFlow cytometry showed that isolated PMSCs exhibited classical immunophenotype of MSCs,including positive CD44,CD73,CD90,CD105,but negative CD34,CD45.Western blot results showed that recombinant adenovirus successfully transfered the PEDF gene into PMSCs and produced secretory PEDF protein.ELISA results showed that PMSCs-PEDF secreted high level of PEDF into the medium[(65.2±4.9)ng/ml].MTT assay showed that PMSCs-PEDF inhibited HUVEC proliferation by 56.3%±8.7% at a 1 ∶2 dilution concentration,and the inhibitory rate decreased with the increase of dilution concentration in a dose-dependent manner.The medium from PMSCs or PMSCs-null had very weak inhibitory effect on the proliferation of HUVECs.The transwell assay demonstrated that PMSCs-PEDF significantly reduced HUVECs migration compared with PMSCs or PMSCs-null(79.4±14.5vs208.8±14.7,199.0±20.7,P<0.05).ConclusionPEDF is highly expressed by PMSCs-PEDF and can inhibit HUVECs proliferation and migration.

pigment epithelium-derived factor； placenta mesenchymal stem cells； human umbilical vein endothelial cell； cell proliferation； cell migration

國家自然科學基金資助項目(30872614)；四川省教育廳理科重點資助項目(15ZA0216，15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項目(14A0017，14A0022)；川北醫學院科研發展計劃項目(CBY14-A-ZD02，CBY15-A-ZD02)；四川省衛計委科研項目(16PJ202)

陳巧玲，女，1983-02生，博士，主治醫師，E-mail:cql166@163.com

2016-12-22

R329

A

1007-6611(2017)03-0226-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.006