哈薩克羊和藏綿羊尾部脂肪組織差異表達基因和可變剪接的鑒定與分析

陶海溪，李貴林，郭家中

(四川農業大學 動物科技學院，成都 611130)

哈薩克羊和藏綿羊尾部脂肪組織差異表達基因和可變剪接的鑒定與分析

陶海溪，李貴林，郭家中

(四川農業大學 動物科技學院，成都 611130)

為鑒定哈薩克羊和藏綿羊尾部脂肪組織的差異表達基因和可變剪接，分別提取6只(3公，3母)無親緣關系的2歲成年哈薩克羊與藏綿羊尾部脂肪組織總RNA，構建2個高通量測序文庫，利用TopHat2軟件將短序列定位到綿羊參考基因組，采用cuffdiff軟件分析基因表達豐度和差異表達基因。結果表明，共有19個基因在 2 個品種綿羊尾脂中的表達豐度均高于1 000 FPKM，包括ADIPOQ、SPARC、VIM等。其中，2 個品種尾部脂肪組織中表達量最高的轉錄本均定位于線粒體基因組5 331～14 154 bp，該區域主要包含 COX1、COX2、ATP8等基因，其表達豐度在哈薩克羊和藏綿羊中分別高達29 724.20 和28 818.80 FPKM。而 FABP4則是表達豐度最高的核基因，在哈薩克羊和藏綿羊中的表達量分別為3 194.03和2 667.09。差異表達基因分析共鑒定出627個差異表達的基因，與藏綿羊尾部脂肪組織的表達量相比，哈薩克羊的尾部脂肪組織中共有221個上調基因和406個下調基因。其中，HBB基因表達量的變化倍數最大，下調約98倍。差異表達基因的富集分析結果表明，哈薩克羊尾脂中上調表達的基因主要參與脂肪酸代謝過程。另外，在2 個品種尾脂中鑒定出11 870個可變剪接事件，其中383個為差異剪接事件。對相關差異表達基因和可變剪接的進一步研究將有助于揭示綿羊肥脂尾形成的分子機制。

肥脂尾；差異表達基因；哈薩克羊；藏綿羊；轉錄組

脂肪組織是動物體內一種主要由脂肪細胞組成的能量貯存器官。一般地，脂肪主要在各種動物的皮下、腹部和內臟器官周圍大量沉積。但在現有綿羊品種中，除上述部位外，許多品種綿羊的尾部具有超強的脂肪存儲能力，從而形成肥臀尾特征。例如，Safdarian等[1]報道伊朗肥脂尾型綿羊尾部的脂肪質量可以達到其胴體質量的20%。在中國的綿羊品種中，最為著名的肥臀尾類型綿羊包括大尾寒羊和哈薩克羊。總的來說，綿羊肥臀(脂)尾是綿羊長期在惡劣環境下生存，受自然選擇作用所形成的一種適應性性狀。在面對營養匱乏、天氣寒冷等惡劣的自然環境時，脂尾型綿羊能夠消耗脂肪提供能量來維持自身的新陳代謝。但是，隨著養羊業的發展和人們需求的改善，綿羊肥脂尾逐漸喪失經濟價值，綿羊尾部脂肪的過度沉積增加飼養成本，降低經濟效益。因此，如何通過遺傳育種措施阻斷脂肪在綿羊尾部的沉積成為綿羊育種工作者關心的重要問題。

目前，研究人員從不同角度對綿羊肥臀尾形成的遺傳機制進行探索。Moradi等[2]利用全基因組SNP芯片檢測到綿羊第5和X染色體 2 個與綿羊肥脂尾形成有顯著關聯的QTL區域。劉真等[3]針對不同尾型綿羊進行群體間選擇信號檢測發現，PPARG基因在肥脂尾綿羊尾脂中的表達量顯著高于瘦尾綿羊。最近，Wang等[4]利用從頭組裝的分析策略，發現 FMO3、 NELL1、THRSP等基因在哈薩克羊和藏綿羊尾部脂肪組織中呈現差異性表達。現有家畜遺傳資源研究表明，中國綿羊品種主要分為：藏綿羊、哈薩克羊和蒙古羊。其中，藏綿羊因長期生活在青藏高原地區，從而對高海拔低氧、寒冷的氣候環境和粗放的飼養方式具有良好的適應能力。此外，藏綿羊具有典型的短尾特征。而主要分布在新疆地區的哈薩克羊則屬于肉脂兼用型綿羊品種。與其他綿羊品種相比，哈薩克綿羊最為突出的表型特征是具有巨大的肥臀尾。為深入了解不同尾型綿羊尾部脂肪沉積能力差異的遺傳機制，本研究利用基于參考基因組的短序列定位策略，鑒定哈薩克羊和藏綿羊尾部脂肪組織中基因的表達豐度特征、差異表達基因以及可變剪接，在轉錄水平上探討綿羊肥脂尾形成的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物組織樣本

在寧夏自治區某羊場分別隨機選擇6只(3 只公羊、3 只母羊)無親緣關系的 2 歲成年哈薩克羊與藏綿羊。分別提取12只綿羊尾部脂肪組織的總RNA，并對提取的RNA進行質量檢測。樣品檢測合格后，從每個品種6個個體的RNA樣品中分別選取等量體積的RNA進行混合，形成2個RNA池(RNA-pool)；然后將混合后的 2 個RNA樣品送至深圳華大基因公司，構建2個高通量測序文庫，采用Illumina Hiseq2000測序儀進行高通量測序。

1.2 讀段比對和組裝

高通量測序后，共獲得117 417 578條100 bp長的原始雙末端讀段(pair-end reads)數據。為去除低質量短序列，對原始讀段進行質量控制，具體參數包括：過濾含有接頭的reads； 過濾掉堿基中N>10%的reads；去除質量值Q≤5 的堿基數占整個reads 50%以上的低質量reads；獲得高質量讀段(clean reads)。使用TopHat2 (v2.0.10)軟件[5]及默認參數，將clean reads比對到綿羊參考基因組[6](ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-77/fasta/ovis_aries/dna/)。采用MarkDuplicates程序 (http://sourceforge.net/projects/picard/)去除重復讀段，最后采用cufflinks[7](v2.2.1) 對上述讀段進行組裝和注釋。

1.3 差異表達基因鑒定和功能富集分析

由于本研究未設置生物學重復，因此利用cuffdiff軟件[7](v1.3.0) 測定基因表達豐度并鑒定差異表達基因(differentially expressed genes，DGEs)。為校正測序深度和基因長度對基因表達量的影響，采用FPKM(fragment per kilobase of exon model per million mapped reads)作為基因表達量的單位。在本研究中，以0.000 5 FPKM作為基因表達豐度的閾值來判定基因是否在樣本組織中表達。差異表達基因的鑒定則采用以下標準： 2 個品種間基因表達倍數的對數變化大于1[(|log2Ratio| ≥1)]；假陽性率(FDR)小于0.001。采用上海博豪開發的生物學通路富集分析在線工具(http://prediction.ebioservice.com:8080/path/)對差異表達基因進行通路富集分析，根據q-value<0.05確定顯著富集的生物學通路。

1.4 可變剪接的鑒定

目前，一般根據可變剪接(alternative splicing,AS)發生的位置將基因的可變剪接分成7類：外顯子跳躍(Exon skipping)、 5′端可變剪接位點(alternative 5′splice sites)、3′端可變剪接位點(alternative 3′splice sites)、外顯子互斥(mutually exclusive exons)、內含子保留(retained introns)、可變的起始外顯子(alternative first exon)和可變的末端外顯子(alternative last exon)。總的來說，基于轉錄組數據的可變剪接分析軟件的分析原理是：利用跨越外顯子讀段(junction reads)提供的信息，將每組樣本數據分別與參考基因組注釋文件進行比較，鑒定每組樣本中的可變剪接。與大部分可變剪接鑒定軟件[7-11]不同的是，ASD軟件[12]的分析策略是將所有待分析的轉錄組樣本數據整合起來，首先鑒定待分析樣本與參考基因組的可變剪接，最終著重于鑒定不同組數據之間發生的差異可變剪接。該軟件更適合于不同品種的相同組織，或不同處理下相同組織的轉錄組數據。因此，本研究采用ASD軟件(http://erp.novelbio.com/ASD/)鑒定可變剪接。

2 結果與分析

2.1 讀段的基因組比對

由表1可知，哈薩克羊尾部脂肪組織轉錄組文庫共包含25 766 605對(51 533 210條)clean reads，約4.6 G序列數據，其平均GC含量50.39%；藏綿羊尾部脂肪組織轉錄組文庫共包含27 747 038對(55 494 076 條)clean reads，約5.0 G序列，其平均GC含量49.19%。clean reads的基因組比對結果表明，在哈薩克羊和藏綿羊的文庫中，分別有21 554 938和23 442 091對reads比對到綿羊參考基因組，分別占總clean reads對的83.65%和84.49%。其中，唯一匹配讀段數量分別為18 715 395和19 953 180對clean reads，分別占總clean reads的72.63% 和71.91%。

2.2 尾部脂肪組織高表達基因

根據表達量≥0.000 5 FPKM的閾值設定，本研究分別在哈薩克羊和藏綿羊尾部脂肪組織中檢測到26 173個和26 345個表達的基因。依據FPKM值，本研究進一步將樣本組織中表達的基因分為低豐度表達基因(< 10 FPKM)，中等豐度表達基因(10 FPKM～500 FPKM)和高豐度表達基因(≥500 FPKM)。在哈薩克羊和藏綿羊的尾部脂肪組織中，表達量小于10 FPKM的基因數目分別占所有表達基因數目的70.02% 和67.77%，表明尾部脂肪組織中大部分基因都處于低豐度表達。而哈薩克羊和藏綿羊尾部脂肪組織中高表達(≥500 FPKM)的基因數目分別為150和165。如表2所示，在 2 個品種脂肪組織中表達量均大于1 000 FPKM的基因共19個，包括ADIPOQ、SPARC、VIM、CYTB、 FTH1、 GPX3、 RPS11、 RPS3A和GSN等基因。其中，在 2 個品種中表達量最高的2 個轉錄本均定位于綿羊線粒體基因組5 331～14 154 bp和0～5 018。上述 2 個區域在哈薩克羊和藏綿羊中的表達豐度為29 724.20 和28 818.80 FPKM，5 476.07和5 244.22 FPKM；這 2 個區域主要包括 COX1、 COX2、 ATP8等基因和 ND1、ND2等基因。在定位到綿羊基因組的基因中，脂肪酸結合蛋白-4( FABP4)的表達豐度最高，其在哈薩克羊和藏綿羊中的表達量分別為3 194.03和2 667.09 FPKM，而FABPs家族的 FABP5也表現出中等豐度的表達量(244.02 和373.41 FPKM)，其他成員均呈現低豐度表達或不表達。另外，脂聯素基因(ADIPOQ)在 2 個品種的尾部脂肪組織中表達量也分別高達2 645.49和1 600.51 FPKM。4個核糖體蛋白基因( RPS11、 RPS3A、 RPS17和 RPS14)在 2 個品種中的表達量大于1 000 FPKM。

表1 2 個文庫clean reads的比對Table 1 Mapping results of clean reads in both libraries

注：百分比表示各種類型讀段占高質量讀段(clean reads)的百分比。

Note:Percentages in the table present percentages of diferent reads in clean read pairs.

表2 2 個綿羊品種表達量高于1 000 FPKM的基因Table 2 Expressed genes showing larger than 1 000 FPKM in both breeds

2.3 哈薩克羊和藏綿羊差異表達基因的鑒定及功能注釋

差異表達基因的分析結果表明，相對于藏綿羊尾部脂肪中的表達豐度，共有627個基因在哈薩克羊尾部脂肪組織中的表達量呈現顯著差異，包括221個上調和406個下調表達的基因。如表3所示，在哈薩克羊中，下調的高豐度表達基因包括HBB(血紅蛋白β)、 ENSOARG00000020789、FNDC1、TGFBR3、CXCL12等基因；而上調的高豐度表達基因則包括Carboxylicesterhydrolase(羧基酯水解酶)和CAT(過氧化氫酶)、THRSP、HSL、 FMO3等基因。在所有差異表達的基因中，HBB基因表達量變化倍數最大；與藏綿羊中的表達量(791.43 FPKM)相比，哈薩克羊尾部脂肪組織中HBB的表達量(8.08 FPKM)下降約 98倍。 差異表達基因的GO生物學過程(biological process,BP)富集分析結果表明，在哈薩克羊中上調表達的基因顯著富集在20個生物學過程。如圖1所示，上調基因顯著富集的過程主要包括9個組織水平或細胞水平的甘油三酯或脂類物質代謝過程，例如，脂類代謝過程(lipid metabolic process， GO:0006629)、甘油三酯催化過程(triglyceride catabolic process，GO:0019433)、細胞脂類物質代謝過程(cellular lipid metabolic process， GO:0044255)等。這些過程主要涉及的差異表達基因包括：MGLL、AADAC、GPLD1、LIPE、PLIN5等。差異表達基因的GO富集分析結果表明，在哈薩克羊中下調表達的基因顯著富集在139個生物學過程。如圖2所示，最顯著富集的20個生物學過程中主要涉及細胞水平的信號傳遞與轉導、免疫應答過程。

2.4 可變剪接事件的檢測

如表4所示，通過與綿羊參考基因組比較，本研究在 2 個品種的尾部脂肪組織中共鑒定到11 870 個可變剪接事件。其中， 3′端可變剪接位點和外顯子缺失分別發生3 622次和3 232次，所占比例最高；而外顯子互斥、可變的起始外顯子和可變的末端外顯子分別發生621、1 157和689次，發生比例較低。根據卡方檢驗(FDR<0.05)，共檢測到383個在 2 個組織間存在的差異可變剪接，其中類型最多的是外顯子跳躍(157次)，涉及132個基因。

圖1 哈薩克羊中上調表達基因最顯著富集的20個GO 生物學過程Fig.1 Top 20 significantly enriched GO biological processes for up-regulated genes in Kazak sheep

圖2 哈薩克羊中下調表達基因最顯著富集的20個GO 生物學過程Fig.2 Top 20 significantly enriched GO biological processes for up-regulated genes in Kazak sheep

表4 2 個品種尾部脂肪組織中不同類型可變剪接的數目Table 4 Summary of different alternative splicing (AS) detected in tails of two breeds

3 討 論

已有研究充分證實[13-14]，線粒體在前脂肪細胞分化和成熟脂肪細胞甘油三酯的合成與水解中扮演著重要作用。例如，細胞內活性氧含量的升高將影響線粒體ATP合成酶的生成，從而抑制3T3-L1細胞的增殖[15]。線粒體拷貝數則與人類白色脂肪組織中脂肪生成過程顯著關聯[16]。本研究發現，包括 COX1、COX2、ATP8和CYTB在內的線粒體基因，在哈薩克羊和藏綿羊尾部脂肪組織均為表達豐度最高的轉錄本，反映出綿羊尾部脂肪組織的代謝非常活躍。脂肪酸結合蛋白家族是脂肪合成與水解過程中重要的調控分子，但是各成員之間的時空表達特征與功能有差異。例如， FABP1基因主要在肝臟中高表達， FABP2基因主要在小腸中高表達；而 FABP4基因則是在脂肪組織中特異性高度表達，促進脂肪組織中脂肪水解，同時抑制脂肪合成[17]。本研究的結果再次證明上述觀點： FABP4在 2 個綿羊品種的脂肪組織中均高水平表達，同時 FABP5也表現出中等豐度的表達，表達量分別為244.02 和373.41 FPKM，而FABPs家族其他成員均呈現低水平表達或不表達。另外，本研究中 4 個核糖核酸蛋白基因的高豐度表達表明，綿羊尾部脂肪組織在翻譯水平的基因表達是非常活躍的。

差異表達基因的鑒定能夠幫助揭示不同類型綿羊尾部脂肪沉積能力差異的分子機制。血紅蛋白β基因(HBB)與動物體攜帶和運輸氧的能力密切相關，被認為是高原人類和動物的高寒適應性進化的一個重要候選基因[18-19]。本研究發現，HBB基因在藏綿羊尾部脂肪組織中的表達量較高，但在哈薩克羊尾部脂肪組織中的表達量則顯著下調。該結果表明，HBB基因可能在藏綿羊脂肪組織的基礎代謝中具有重要功能。已有研究[20]表明，動物脂肪組織中脂類物質代謝過程會產生大量的活性氧類物質。而過氧化氫酶的主要作用是分解過氧化氫，從而阻止后者在生物體內進一步分解成有害的自由基。在本研究中，過氧化氫酶基因在哈薩克羊尾部脂肪中表達量升高，這可能是由于哈薩克羊尾部脂肪組織需要清除高度活躍的代謝過程所產生的大量過氧化氫。激素敏感酯酶(HSL)是動物體脂肪分解過程中的一個關鍵酶，其主要負責水解甘油三酯、甘油二酯以及膽固醇酯，HSL基因的缺失能導致甘油二酯在小鼠脂肪和肌肉組織中的堆積[21]，從而影響脂肪水解。本研究發現，HSL在哈薩克羊尾部脂肪組織中的表達量顯著高于其在藏綿羊中的表達豐度，暗示著哈薩克羊肥脂尾中的脂肪分解比藏綿羊尾部脂肪中的代謝更為活躍。總的來說，與藏綿羊相比，在哈薩克羊尾部脂肪組織中顯著上調的基因主要富集在脂肪代謝相關的生物學過程中，表明哈薩克羊尾部組織中脂肪代謝比藏綿羊中的脂肪代謝顯著活躍。而下調表達的基因所富集的一些通路則與免疫過程相關。與Wang等[4]利用從頭組裝分析策略檢測到的差異表達基因相比，本研究共檢測到60個相同的上調表達基因，46個相同的下調表達基因。相同的上調表達基因包括THRSP、FMO3等，這些基因在肥臀尾綿羊的尾部脂肪沉積中的作用值得進一步研究。

可變剪接廣泛存在于動物各種組織的基因表達過程中[22-23]，并被認為是導致動植物基因轉錄調控復雜性的一個重要原因。已有研究表明，動物脂肪組織中存在大量可變剪接并且是脂肪細胞分化的必要條件[24]，剪接因子 SRSF10基因的缺失將阻礙前脂肪細胞的分化，從而影響皮下白色脂肪的發育過程。可變剪接的發生與動物的肥胖和胰島素抗性有密切關系[25]。例如， LPIN1基因的一種剪接體 LPIN1 α 主要在前脂肪細胞的分化中發揮作用，而另一種剪接體 LPIN1 β則會促進前脂肪細胞增殖[26]。本研究發現，與綿羊參考基因組相比， LPIN1 基因也存在可變剪接，其剪接類型為5′端可變剪接。本研究的結果表明，綿羊脂肪組織中存在著大量的可變剪接。在所檢測到的不同類型可變剪接中，3′端可變剪接和外顯子跳躍發生的比例最高，這與已有研究[24]相一致，另外，有多個基因(例如 C4)的可變剪接在 2 個品種脂肪組織中存在差異，表明可變剪接可能在不同尾型綿羊尾部脂肪沉積中發揮重要作用。但相關基因的可變剪接準確位置及形成的不同轉錄本作用還有待于通過試驗進一步證實。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Identification and Analysis of Differentially Expressed Genes and Alternative Splicing in Adipose Tissue from Tails between Kazak and Tibetan Sheep

TAO Haixi,LI Guilin and GUO Jiazhong

(College of Animal Science and Technology,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

This study aims to investigate the expression profiles and alternative splicing patterns of the genes expressed in the adipose from tails of Kazak (KS) and Tibetan (TS) sheep.Six two-year old unrelated adult individuals (three males and three females) for KS and TS breeds were randomly selected from a sheep farm located in Ningxia Autonomous Region,respectively.Total RNA from six sampled individuals of each breeds were extracted and mixed into a RNA-pool which was then used to construct the high-throughput sequencing library.A total of 19 genes showed high expression levels with more than 1 000 FPKM,such asADIPOQ,SPARC,andVIM.The most abundantly expressed transcripts which mainly included COX1,COX2.The ATP8 was mapped to 5 331-14 154 bp of the mitochondrial genome in both breeds,and the expression abundance of this transcript were 29 724.20 and 28 818.80 FPKM in KS and TS,respectively.The expression levels of FABP4 most highly expressed nuclear gene were 3 194.03 FPKM in KS breeds and 2 667.09 in TS breeds,respectively.Comparing TS group with KS group,a total of 627 differentially expressed genes (DEGs) were identified,including 221 up-regulated and 406 down-regulated genes.Notably,HBBshowed largest down-regulation expression change in the fat tail of Kazak sheep.GO enrichment analysis revealed that the up-regulated expressed genes in KS sheep were significantly related with fatty acid metabolism processes.In addition,we detected a total of 11 870 alternative splicing events in the two breed samples,of which 383 splicing events were significantly discrepant between the two breeds.The further studies for the differentially expressed genes and alternative splicing will better understand the molecular mechanisms underlying sheep fat-tail.

Fat-tail; Differentially expressed genes; Kazak sheep; Tibetan sheep; Transcriptome

TAO Haixi,male,master student.Research area:sheep and goat genetics and breeding.E-mail:thx0218@sina@qq.com

GUO Jiazhong,male,Ph.D,lecturer.Research area:sheep and goat genetics and breeding.E-mail:jiazhong.guo@sicau.edu.cn

日期：2017-03-03

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0836.074.html

2016-04-26

2016-06-07

四川省教育廳項目(15ZB0005)。

陶海溪，男，碩士研究生，從事動物遺傳育種研究。E-mail:thx0218@sina.com

郭家中，男，博士，講師，主要從事草食家畜遺傳育種研究。E-mail:jiazhong.guo@sicau.edu.cn

S826

A

1004-1389(2017)03-0342-08

Received 2016-04-26 Returned 2016-06-07

Foundation item Programs supported by Department of Education of Sichuan Povince(No.15ZB0005).