易變鏈霉菌TRM 45540四氫嘧啶合成相關基因的克隆

張慧艷，劉芝瑾，徐 同，馬金福，梁 凱，羅曉霞

(新疆生產建設兵團 塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室/塔里木大學 生命科學學院，新疆阿拉爾 843300)

易變鏈霉菌TRM 45540四氫嘧啶合成相關基因的克隆

張慧艷，劉芝瑾，徐 同，馬金福，梁 凱，羅曉霞

(新疆生產建設兵團 塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室/塔里木大學 生命科學學院，新疆阿拉爾 843300)

為了探索嗜鹽放線菌對高鹽環境的適應機理,以分離于羅布泊易變鏈霉菌TRM 45540為材料，利用分子克隆技術，構建四氫嘧啶異源生物合成工程菌(以E.coli為宿主)，對ectA、ectB、ectC與ectABC基因進行異源表達，分析異源宿主菌的耐鹽能力。結果表明：TRM 45540四氫嘧啶合成相關基因ectA為 474 bp，預測編碼蛋白為19 ku；ectB為1 272 bp，預測編碼蛋白為44.6 ku；ectC為399 bp，預測編碼蛋白為19 ku；全長基因ectABC為2 403 bp，并且攜帶有ectABC基因工程菌的耐鹽能力顯著提高。

易變鏈霉菌；四氫嘧啶；基因克隆

極端微生物因其在極端環境中特殊的適應能力，引起科學家的廣泛興趣并成為微生物研究領域的熱點[1]。中度嗜鹽菌與極端嗜鹽菌相比，具有更寬的鹽適應范圍。中度嗜鹽菌通常能夠在細胞內高濃度累積小分子有機滲透溶質，如糖、多元醇、甜菜堿及氨基酸等，使細胞內外滲透壓達到平衡[2-5]。Galinski通過HPLC和NMR的方法對不同鹽環境菌株細胞內相容性溶質進行分析，結果發現，在放線菌中的相容性物質種類豐富，四氫嘧啶是一種主要的相容性溶質存在于細胞質中[6]，而中度嗜鹽菌為了在高鹽環境下求得生存，需要依賴這種相容性物質，在以色列鹽單胞菌[7]、嗜鹽海球菌[8]、巴斯德氏鹽水芽孢桿菌[9]均有報道。

四氫嘧啶為N-乙酰化二氨基丁酸通過分子內脫水形成的一種嘧啶衍生物，四氫嘧啶分子結構特點是高度水溶性、不帶靜電荷，在細胞內高濃度積累可以提高細胞內的滲透壓，但不會影響生物大分子的正常生理功能。以天冬氨酸為前體的四氫嘧啶合成途徑，是由 L-天冬氨酸-β-半醛(ASA)開始合成的，中間經過3個步驟，第1個反應：2,4-二氨基丁酸轉氨酶(EctB)催化ASA生成L-2,4-二氨基丁酸(DABA)；第2個反應：2,4-二氨基丁酸乙酰轉移酶(EctA)將DABA乙?；蒒-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸(ADABA)；最后，四氫嘧啶合成酶(EctC)催化ADABA環化成四氫嘧啶[10-11]。

菌株TRM 45540分離于新疆羅布泊土壤環境，NaCl適應范圍廣，生長快，為典型的中度嗜鹽菌，是研究耐鹽放線菌耐鹽機制的良好材料。本研究通過分析已發表四氫嘧啶合成基因相關序列的保守結構域，利用生物信息學技術，掃描TRM 45540菌株的全基因組序列[12]，找到與四氫嘧啶合成相關的序列，以此設計引物，擴增獲得四氫嘧啶合成相關基因ectABC，獲得ectABC重組子，檢測重組子對不同質量濃度NaCl的耐受能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 易變鏈霉菌(Streptomycesmutabilis) TRM 45540 (與標準菌株StreptomycesmutabilisNBRC 12800T相似性為99.79%)。使用ISP-4培養基，添加0.05 g/mL NaCl，37 ℃培養5～7 d。

1.1.2 主要儀器和試劑 PCR儀:德國Senso Quest Labcycler；凝膠成像系統：美國BIO-RAD；高速離心機：德國Eppendorf；電泳儀：北京六一。

菌株或質粒：表達載體pET-28a(+)和E.coliBL21(DE3)感受態細胞均來自塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室微生物資源研究室。

PCR擴增全套試劑購自廣州東盛生物科技有限公司；連接試劑盒，pMD18-T載體試劑盒，限制性內切酶HindⅢ，BamH Ⅰ和EcoRⅠ，T4DNA Ligase購自寶生物工程有限公司(TaKaRa)；膠回收試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；一抗：抗His標簽鼠單克隆抗體(Protein FindTMAnti-His Mouse Monoclonal antibody)，二抗：辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)抗體(Protein FindTMGoatAnti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate)購自北京全式金生物技術有限公司(TransGen)；其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 四氫嘧啶合成相關基因克隆

四氫嘧啶合成過程中相關的基因有3個：ectA，ectB和ectC。在四氫嘧啶合成基因簇中，ectABC基因形成1個操縱子結構，共用1個啟動子。通過GenBank中已發表的ectABC序列，找到每個基因的保守結構域，利用生物信息學技術，掃描菌株的全基因組序列[12]，分別找到多條與四氫嘧啶合成基因相關的區域，選擇相鄰近的3段區域設計引物，進行PCR擴增，得到與四氫嘧啶合成相關的基因ectA，ectB和ectC及ectABC全長序列，轉化E.coliDH5α感受態細胞，將獲得的陽性轉化子送樣測序。

引物設計見表1(下劃線表示加入的酶切位點)：下劃線堿基GGATCC為限制性內切酶BamHⅠ，下劃線堿基AAGCTT為限制性內切酶HindⅢ，下劃線堿基GAATTC為限制性內切酶EcoRⅠ。

表1 四氫嘧啶基因引物序列Table 1 Primer sequence of ectoine gene

1.3 表達質粒的構建與轉化

用BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對目的PCR片段和表達載體pET 28a分別進行雙酶切(ectA基因用BamHⅠ和HindⅢ，ectB基因用EcoRⅠ和HindⅢ，ectC基因用BamHⅠ和HindⅢ)，酶切后用T4DNA連接酶連接獲得重組質粒，轉化E.coliBL21(DE3)感受態細胞，PCR驗證重組子，挑取陽性克隆子測序。

1.4 Western blot 檢測

將純化的EctA，EctB和EctC蛋白進行SDS-PAGE檢測，用Mini-Trans Blot 轉膜儀120 V 電壓轉膜1 h，用封閉液進行過夜封閉后，分別用一抗二抗各孵育1 h后，用DAB顯色。

1.5 耐鹽度測定

配制不同NaCl質量濃度的LB培養基，以載體和E.coliBL21(DE3)感受態細胞為對照，觀察重組子的耐鹽性。

2 結果與分析

2.1 四氫嘧啶合成基因的克隆

2.1.1ectC的克隆 通過全基因組掃描，在菌株TRM 45540基因組中篩選到1條與ectC基因相似的序列，以篩選的序列為模板設計引物，經PCR擴增后，擴增到與目的條帶一樣大小的片段(圖1)，大小為399 bp，將擴增得到的片段克隆測序后與NCBI數據庫序列進行比對，發現其具有Ectoin_synth保守結構域，與四氫嘧啶合成相關，并且該片段與已發表的四氫嘧啶合酶(ectoine synthase)的一致性為98%。

ectABC基因形成一個操縱子結構，通過保守結構域的分析及預測，在TRM 45540菌株基因組中分別掃描預測到1條與ectA和ectB基因相關的序列(圖1-A)。以TRM 45540的總DNA為模板，以45540ectA-R，45540ectA-F和45540ectB-R，45540ectB-F為引物進行PCR擴增，結果見圖1。引物對45540ectA-F和45540ectA-R擴增得到與預期大小相符的片段約500 bp(圖1-B)，引物對45540ectB-F和45540ectB-R擴增得到與預期片段大小相符的約1 200 bp 的片段。引物對ectA-F和ectC-R擴增得到四氫嘧啶合成基因簇ectABC的全長序列，ectABC全長約 2 403 bp(圖1)。將PCR擴增的目標片段進行雙酶切后與載體進行連接并轉化DH5α。用堿裂解法抽提重組菌的質粒(圖1-C)，分別對重組質粒ectA+T/DH5α (HindⅢ+BamHⅠ),ectB+T/DH5α(HindⅢ+EcoRⅠ)和ectC+T/DH5α(HindⅢ+BamHⅠ)進行雙酶切驗證。TRM 45540四氫嘧啶合成相關基因ectA為474 bp，ectB為1 272 bp，ectC為399 bp，全長基因ectABC為2 403 bp(圖1-D)。

A.四氫嘧啶合成基因的結構; ectA有474 bp,ectB有1 272 bp,ectC有399 bp,ectABC有2 403 bp。 B.四氫嘧啶合成基因的PCR擴增結果; M.DNA marker(DL2000),1.ectA(474 bp),2.ectB(1 272 bp),3.ectC(399 bp),4.ectABC(2 403 bp)。C.四氫嘧啶合成基因重組質粒驗證; 1.pUC19/DH5α,2.ectA+T/DH5α,3.pUC19/DH5α,4.ectB+T/DH5α,5.pUC19/DH5α,6.ectC+T/DH5α,7.pUC19/DH5α,8.ectABC+T/DH5α。 D.四氫嘧啶合成基因重組質粒的酶切驗證; 1.ectA+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ，2.ectA+T/DH5α，3.ectB+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 4.ectB+T/DH5α， 5.ectC+T/DH5α(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 6.ectC+T/DH5α， 7.ectABC+T/DH5α (Hind Ⅲ+EcoRⅠ)， 8.ectABC+T/DH5α，9.pUC19(Hind Ⅲ+EcoRⅠ)，10.pUC19， M1.DNA Marker(plusⅡ)，M2.DNA Marker(λHind Ⅲ)

2.1.2ectA、ectB和ectC基因的分析及異源表達 通過與NCBI數據庫進行比對分析ectA、ectB、ectC基因的保守結構域，結果顯示：TRM 45540中ectA基因含有1個與2，4-二氨基丁酸乙酰轉移酶(2,4-diaminobutyric acid acetyltransferase)合成相關的保守結構域NAT-SF(N-Acyltransferase superfamily)；將序列通過Blastx比對，發現TRM 45540ectA基因與Streptomycessp.TOR3209的2,4-diaminobutyric acid acetyltransferase一致性為97%，對ectA基因進行異源表達，通過SDS-PAGE檢測EctA蛋白大小為19 ku，與預測大小一致(圖2-A)；ectB基因含有1個與2，4-二氨基丁酸轉氨酶(L-2,4-diaminobutyric aminotransferase)合成相關的保守結構域AAT-I superfamily(Aspartate aminotransferase superfamily)，將序列通過Blastx比對，ectB基因與StreptomycesbottropensisATCC 25435的L-2,4-diaminobutyric aminotransferase一致性為93%，對ectB基因進行異源表達，通過SDS-PAGE檢測EctB大小為44.6 ku，與預測大小一致(圖2-B)；ectC基因含有1個與四氫嘧啶合成酶(ectoine synthase)合成相關的保守結構域EctC(Ectoine-synth Superfamily)，將序列通過Blastx比對，TRM 45540ectC基因與Streptomycessp.TOR3209的ectoine synthase 一致性為98%,對ectC基因進行異源表達，通過SDS-PAGE檢測EctC大小為19 ku，與預測大小一致(圖2-C)。

2.2 四氫嘧啶合成基因的耐鹽性鑒定

將攜帶有四氫嘧啶基因的重組菌分別接種于含NaCl 0、0.01、0.03、0.05 g/mL的LB培養基中，以pET32a/DH5α、puc19/DH5α和pET32a/ BL21(DE3) (載體)為陰性對照，以TRM 45540 為陽性對照，觀察重組子的耐鹽性(圖3)。

由圖3可以看出，重組菌能夠在0.01 g/mL含鹽培養基上生長，而在0.03 g/mL的培養基上生長較為微弱，在0.05 g/mL的含鹽培養基上不能生長，pET 28a/ DH5α、pET 28a/ DH5α和pET 28a/ BL21(DE3)均不能在0.03 g/mL和0.05 g/mL的含鹽培養基上生長。而包含有ect基因的重組菌ectABC+pET-28a/DH5α、ectABC+pET-28a/BL21(DE3)能夠在0.05 g/mL含鹽培養基中生長，由此證明ect基因能夠提高重組菌對NaCl的耐受性。

A: ectA基因的異源表達SDS-PAGE檢測, M.蛋白質Marker(80 ku),1. pET-28a/BL21(DE3), 2. ectA+pET-28a/ BL21(DE3), 3.Ect5A(上樣量為5 μL) , 4. Ect5A(上樣量為10 μL); B: ectB基因的異源表達SDS-PAGE檢測, M.蛋白質Marker(80 ku),1.ectB+pET-28a/BL21(DE3), 2.EctB(上樣量為5 μL), 3. EctB(上樣量為10 μL), 4. pET-28a/BL21(DE3); C: ectC基因的異源表達SDS-PAGE檢測, M. 蛋白質Marker(80 ku), 1. EctC(上樣量為 5 μL), 2. ectC+pET-28a/BL21(DE3), 3. pET-28a/BL21, 4.EctC(上樣量為 10 μL); D: EctA、 EctB、EctC蛋白Western blot 檢測, M. 蛋白質Marker(80 ku), 1. EctA, 2.EctB, 3.EctC,4.pET-28a/BL21

3 討 論

嗜鹽放線菌分布廣泛，不論是普通環境的低鹽土壤還是飽和鹽濃度的環境均能存在，他們包含幾乎所有的代謝類型，他們獨特的基因類型，特殊的生理機制及包括次級代謝產物在內的新活性分子，使鹽環境，尤其是極端鹽環境成為發現新微生物資源及新活性分子的寶庫。羅布泊位于新疆塔里木盆地東部，若羌縣境內，曾是中國第二大內陸湖，在20世紀中后期因塔里木河流量減少，周圍沙漠化嚴重，使其迅速退化并干涸。羅布泊含有豐富的鉀鹽礦藏資源，是國內為數不多超大型鉀鹽礦之一[13]。這為研究中度嗜鹽菌鹽適應機制提供一個嶄新的平臺。

四氫嘧啶是一種廣泛存在于嗜鹽微生物中的相容性溶質。在高滲透壓脅迫下，嗜鹽微生物會在細胞內累積大量四氫嘧啶來平衡細胞內外滲透壓；在低滲透壓下，微生物則會向細胞外釋放細胞內的四氫嘧啶。通過這種方式，使許多嗜鹽微生物可以在高溫、干旱、鹽堿等極端環境存活。目前已從多種微生物中克隆到與四氫嘧啶合成相關的基因[14]。

本試驗以一株完成全基因組測序的中度嗜鹽鏈霉菌為研究對象，通過生物信息學分析預測除與四氫嘧啶合成基因簇相關的序列，以基因組序列作為模板設計四氫嘧啶合成基因簇的引物，擴增得到目標片段并進行測序驗證。TRM 45540四氫嘧啶合成相關的基因全長2 403 bp，由3個ORF組成，為一個操縱子結構。通過BLAST比對分析，TRM 45540與Streptomycessp.TOR3209的ectABC基因親緣關系最相近，TRM 40136ectABC基因可能為一新基因。通過鹽耐受試驗表明，TRM 45540 四氫嘧啶合成相關的基因能夠提高重組菌對NaCl的耐受能力。生理生化試驗表明，TRM 45540可在0～0.08 g/mL的NaCl質量濃度下生長，最適生長的NaCl質量濃度為0.05 g/mL，通過重組菌鹽耐受試驗，發現TRM 45540的四氫嘧啶合成相關的基因明顯提高重組菌的鹽耐受能力，但是重組菌對NaCl的耐受能力僅為0.05 g/mL，而不同于野生菌TRM 45540可以耐受較高的NaCl質量濃度，通過對TRM 45540的全基因組序列分析，還發現在TRM 45540中存在多個與耐鹽相關的相容性溶質合成基因，如海藻糖合成相關基因(tps和tpp)、甘露醇合成相關基因(mtlD)和甜菜堿合成相關基因(betA和betB)等。因此推測：TRM 45540之所以能夠耐受較高的NaCl質量濃度，可能與多個相容性溶質協同作用有關。

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(責任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Cloning of Biosynthetic Gene Cluster of Ectoine fromStreptomycesmutabilisTRM 45540

ZHANG Huiyan,LIU Zhijin,XU Tong,MA Jinfu,LIANG Kai and LUO Xiaoxia

(Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production&Construction Corps/College of Life Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)

The aim of this study is to conduct research into adaptive mechanism of halophile actinomycetes in hypersaline environments.The wide type strainStreptomycesmutabilisTRM 45540 was used as material,we inserted theectA,ectB,ectCandectABCinto the expression vector pET28a to generate recombinant plasmidsectABC+pET-28a/BL21(DE3),then analyzed the salt tolerance of recombinants.The results showed thatectABCgene was 2 403 bp,including three subunits such asectA,ectBandectC.EctAgene was 474 bp,the encoding protein 19 ku,ectBgene 1 272 bp,the encoding protein 44.6 ku;ectCgene was 399 bp,the encoding protein was 19 ku.Moreover,the recombinant showed higher salt tolerance.

Streptomycesmutabilis；Ectoine；Gene clone

ZHANG Huiyan,female,undergraduate.Research area:application of biological science.E-mail: 1018630306@qq.com

LUO Xiaoxia,female,associate professor.Research area:extremophiles functional genes.E-mail：xxluo415@163.com

日期：2017-03-03

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0832.046.html

2016-01-24

2016-07-25

兵團博士基金(2014BB008)；塔里木大學校長基金(TDZKBS201301)；塔里木大學國家級大學生創新項目(201410757012)。

張慧艷,女，本科生，研究方向為應用生物科學。E-mail：1018630306@qq.com

羅曉霞，女，副教授，研究方向為極端微生物功能基因。E-mail：xxluo415@163.com

Q786

A

1004-1389(2017)03-0471-06

Received 2016-01-24 Returned 2016-07-25

Foundation item Ph.D Foundation of Xinjiang Production & Construction Corps(No.2014BB008); the President Foundation of Tarim University (No.TDZKBS201301); National Innovative Project for College Students(No.201410757012).