齊墩果酸對急性髓系白血病鼠cav-1基因表達的影響①

楊 玉，侯 玥，吳天琪，馮 靖，王迪迪，張鵬霞，于 蓮

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯154007；2.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯154007； 3佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯154007)

齊墩果酸對急性髓系白血病鼠cav-1基因表達的影響①

楊 玉1，侯 玥2，吳天琪2，馮 靖2，王迪迪1，張鵬霞1，于 蓮3

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯154007；2.佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯154007； 3佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯154007)

目的：本研究通過體內實驗探討齊墩果酸(oleanolic acid，OA)對急性髓系白血病的治療作用及其對膜蛋白cav-1表達的影響。方法：通過尾靜脈注射HL-60細胞于SCID小鼠制備動物模型，并于3周后給予OA治療。在此期間，觀察一般情況變化，并計數白細胞。RT-PCR法分析cav-1mRNA表達。結果：白血病移植模型小鼠使用OA治療后生存時間延長、體重增加、白細胞數量降低，cav-1mRNA表達增加。結論：OA可緩解急性髓系白血病病情進展的療效，其作用可能與增加cav-1基因表達有關。

齊墩果酸；cavelin-1；急性髓系白血病

窖蛋白-1(cavelin-1，cav-1)是胞膜窖的主要組成成分，并廣泛參與各種細胞信號通路，與癌癥的發生發展密切相關[1]。本課題組前期研究證實，cav-1在白血病HL-60細胞中表達下降，其在急性髓系白血病中扮演抑癌基因的角色[2～4]。在白血病動物模型中, cav-1的作用尚未得到證實。本實驗通過制備白血病移植瘤模型，并以經體外研究證實具有抑制HL-60細胞增殖作用的藥物齊墩果酸予以干預[5]。檢測各組移植模型鼠的cav-1基因表達情況，探討cav-1在白血病發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

重癥聯合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency mice，SCID)購自北京維通利華實驗技術有限公司[合格證明編號：SCXX(京)2007-0001]，急性早幼粒細胞系細胞株HL-60購買于中科院上海生命科學院。齊墩果酸從中國藥品生物制品檢定所購買。RT-PCR試劑盒及引物合成服務均由Takara公司提供。實驗室常規傳代培養HL-60細胞。

1.2 實驗動物飼養及分組

體重(15±2)g的雌性SICD鼠30只，飼養于SPF級實驗室。實驗設正常對照組、模型對照組與OA干預組，隨機每組分配10只小鼠。

1.3 動物模型制備及藥物干預

模型組與干預組動物連續兩天經腹腔注射環磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)3mg/d/只。第3天取對數生長期HL-60細胞，以RPMI-1640培養基重懸并調整細胞濃度至2×107/mL，取0.5mL細胞懸液尾靜脈注射動物。造模第21d，干預組鼠皮下注射OA，劑量200mg/kg；模型組鼠經皮下注射等量2% Tween-80，連續給藥14d。觀察小鼠的精神狀態、體重變化、生存時間等一般情況。

1.4 白細胞計數

第3、5周，各組小鼠取血20μL加入0.38mL稀釋液底部，混勻至呈褐色，10倍鏡下計數。

1.5 RT-PCR檢測cav-1mRNA的表達

造模第36天，眼后靜脈叢法獲得各組小鼠外周血，分離并收集白細胞，Trizol法提取總RNA。RT-PCR按試劑盒說明書操作，產物大小362bp。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠一般情況檢查

2.1.1 成瘤情況與全身狀況：接種HL-60細胞3周后，SCID小鼠可見腹部膨脹，解剖腹腔可見瘤塊。結合在25d左右觀察到小鼠出現精神萎靡、食欲降低、可觸摸到肝脾腫大等全身狀況的改變，說明成功建立白血病移植瘤模型。

2.1.2 體重改變與存活時間：OA治療2周后，小鼠體重與模型組比較明顯增加(P<0.05)，并且與2周前比較小鼠體重沒有明顯下降(P>0.05)，見表2。OA干預組小鼠存活時間(55.8±7.6)d與模型組鼠存活時間(41.1±4.8)d相比明顯延長(P<0.01)。

表2 各組小鼠體重情況±s，g)

2.2 白細胞計數結果

造模第3、5周檢測，模型組動物白細胞隨時間延長而明顯增高(P<0.05)，OA干預組動物白細胞未見明顯升高(P>0.05)。第5周，干預組動物白細胞數量與模型組相比明顯降低，但仍未恢復至正常水平，各組間比較具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠白細胞計數結果

2.3 外周血白細胞cav-1mRNA表達水平

與模型組比較，OA干預組動物的cav-1mRNA表達水平增加，見圖1。

圖1 外周血白細胞cav-1mRNA表達水平

注：M：Marker；N：正常組；OA：OA干預組；C：模型對照組

3 討論

SCID鼠是經典模式生物，由位于第16號染色體的scid基因突變所致。SCID鼠表現為嚴重缺乏功能成熟的T、B細胞，但是其仍保留有一定的免疫防御功能，如其NK細胞功能并未受損[6]?；诖?，本實驗在接種前經腹腔注射環磷酰胺清除NK細胞，以保障移植瘤的正常生長。從成瘤情況、體重改變、全身狀況等都說明我們成功的建立了急性髓系白血病SCID移植模型鼠[5]。

OA是五環三萜類化合物，無明顯毒副作用。天然及合成的OA能調節多條信號通路，具有強的抗腫瘤與抗血管生成活性[7]。基于早期治療的原則，我們于能觀察到瘤塊形成的造模第3周開始OA干預治療。從體重改變、存活時間與白細胞計數方面的結果來看，OA確實具有抗白血病的療效，該結果也與我們在體外實驗得到的結果相一致。cav-1的mRNA表達水平在模型鼠中是降低的，OA干預后隨著白血病移植模型鼠癥狀的緩解，cav-1的水平升高。cav-1作用具有復雜性，可以通過多個信號通路調控腫瘤的發生與進展。在不同白細胞腫瘤細胞中，其表達亦有所不同，如在成人T細胞白血病中即表達增加[8]。從實驗結果分析，我們推測cav-1在急性髓系白血病移植模型鼠中可能扮演著抑癌基因的角色，但是我們尚無法確定在OA的干預下的病情緩解與cav-1水平升高之間的因果關系，也就是說cav-1的表達水平也可能是隨著病情緩解而有所恢復的。在后續實驗中，我們將從信號通路與腫瘤細胞凋亡的角度，進一步研究OA對急性髓系白血病的干預機制及其與cav-1表達改變的關聯。

[1]何其勇,付先東, 國麟棋. 肝再生過程中膽汁酸對caveolin-1表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(3): 85-86

[2]馬微，李麗，楊永旭，等.Cav-1基因在五種白血病細胞中的表達[J].中國老年學雜志，2013,33(19)：4754-4756

[3]WeiMa,Di-DiWang,Peng-XiaZhang.Caveolin-1playsakeyroleinOleanolicacid-inducedapoptosisofHL-60cells[J].OncologyReports, 2014, 32(1):293-301

[4]王迪迪，馬微，葛堂棟，等.齊墩果酸對白血病HL-60細胞PI3K、Akt、Cav-1表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(6):1-2

[5]DewanMZ,TerunumaH,AhmedS,etal.NaturalkillercellsinbreastcancercellgrowthandmetastasisinSCIDmice[J].BiomedPharmacother,2005, 59(Suppl2): 375-379

[6]楊穎，蔡玟，黃志彪，等. 環磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型建立與評價[J]. 中國公共衛生，2008，24(5)：581-582

[7]ShanmugamMK,DaiX,KumarAP,etal.Oleanolicacidanditssyntheticderivativesforthepreventionandtherapyofcancer:preclinicalandclinicalevidence[J].CancerLett, 2014, 346(2):206-216

[8]馬微，王迪迪，王昭，等. 慢病毒介導的cav-1過表達對HL-60細胞增殖與凋亡的影響[J]. 中國實驗血液學雜志，2013：21(4)：905-910

1.國家自然科學基金面上項目，編號：81274101；81070428;2.佳木斯大學校級交叉學科研究項目，編號：jc2014-001；3.佳木斯大學創新團隊，編號：cxtd-2016-03；4.國家級大學生創新創業訓練計劃項目，編號：201510222002；5.省級大學生創新創業訓練計劃項目，編號：201410222027，201410222047。

楊玉(1982～)女，黑龍江寶清人，碩士，講師。

張鵬霞(1967～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，博士研究生導師。E-mail:pengxiaz@163.com。

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1008-0104(2017)01-0001-02

2016-09-20)