規?；囵B豬瘟活疫苗生產工藝的試驗

郁宏偉, 鄭朝朝， 柳 珊， 劉 濤, 劉云濤， 鄒立宏

[1.瑞普(保定)生物藥業有限公司，河北保定071000； 2.河北省獸醫生物技術工程技術研究中心，河北保定071000]

規?；囵B豬瘟活疫苗生產工藝的試驗

郁宏偉1,2, 鄭朝朝1,2， 柳 珊1,2， 劉 濤1,2, 劉云濤1,2， 鄒立宏1,2

[1.瑞普(保定)生物藥業有限公司，河北保定071000； 2.河北省獸醫生物技術工程技術研究中心，河北保定071000]

為建立一種快速、穩定的規?；囵B豬瘟活疫苗的生產工藝，本試驗將已感染豬瘟病毒的細胞直接接種到生物反應器(工作體積為10 L)，收獲病毒液，制備成豬瘟活疫苗。研究結果顯示，接種帶毒細胞后培養3 d細胞數可增長4～6倍，15 d可收獲毒液7次，病毒收獲量至少與600個10 L轉瓶單次收獲量相當，產品各項檢測均合格。本試驗所建立的生產工藝可大幅度縮短培養時間，提高生產效率，為規?；囵B工藝的推廣與使用提供了技術參數。

豬瘟 ； 規?；囵B ； 生物反應器

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，嚴重危害養豬業[1]。豬瘟被世界動物衛生組織列為必須報告的動物傳染病，中國也將其列為一類動物疫病[2]。接種疫苗是預防和控制豬瘟的有效手段。近年來豬瘟常有免疫失敗的報道，究其原因疫苗的質量與之有很大的關系[3]。豬瘟疫苗各生產廠家的水平參差不齊，經常出現疫苗效價不穩定，病毒滴度低等問題[4]。因此，本行業亟需提高疫苗產品質量以滿足市場需要。應用生物反應器制備疫苗抗原已經成為國內各獸用生物制品生產企業關注和研究的焦點[5]。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒及試驗動物 豬睪丸細胞(ST)，購自廣東永順生物制藥股份有限公司；豬瘟病毒兔化弱毒株脾毒(CSFV)，由瑞普(保定)生物藥業有限公司種毒室提供；安全檢驗用豬瘟抗體陰性豬，購自河北唐縣某豬場；效力檢驗用家兔，購自河北定州某兔場。

1.2 主要試劑、設備 MEM培養基，購自GIBCO公司；葡萄糖測定試劑盒，購自上海榮盛生物藥業有限公司；豬瘟專用新生牛血清，購自武漢三利生物工程有限公司；胰蛋白酶，購自GIBCO公司；AP20C型激流灌注式多功能生物反應系統，購自杭州安普生物工程有限公司(工作容積10 L)。

1.3 帶毒細胞制備 以常規方法復蘇、傳代、增殖ST細胞，至長成良好單層后棄去培養液，接種脾毒，接毒量為3 g/瓶，置于37 ℃溫室中繼續培養。接毒后第4天進行第一次收獲換液，接毒后第8天將已接毒ST消化制備成帶毒細胞懸液，備用。

1.4 帶毒細胞罐體接種與培養 將帶毒細胞懸液接種至生物反應器內。設定設備參數：T1：37 ℃、T2：40 ℃、T3：36 ℃，pH值：7.4，DO值：50%～70%，振蕩速度20 r/min，空氣流量100 ml/min，啟動培養程序，開始病毒培養。當殘糖濃度低于1 g/L時，開始補液或者換液，維持殘糖濃度，并分析細胞生長情況。

1.5 病毒培養、收獲 帶毒細胞培養至第3天進行第一次收獲，2～7收每48 h進行一次收獲，1～6收每次收獲完成后向系統內補充9 L細胞維持液，補液后24 h補充200 g/L的葡萄糖，使殘糖濃度維持在0.7 g/L。

1.6 半成品檢驗 無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行。半成品病毒含量測定用兔體定型熱反應和間接免疫熒光兩種方法測定。

1.7 疫苗的制備與檢驗

1.7.1 疫苗制備 將檢驗合格的病毒液稀釋后混合于同一容器，加入等體積牛乳蔗糖凍干保護劑(5%蔗糖和12%脫脂乳)充分搖勻，定量分裝，迅速冷凍真空干燥即得成品。

1.7.2 疫苗安全性檢驗 按瓶簽注明頭份，將疫苗用生理鹽水稀釋為每毫升含6頭份，肌肉注射CSFV抗體陰性健康豬5頭，每頭5 mL，觀察21 d。

1.7.3 疫苗效力檢驗 將疫苗用生理鹽水稀釋成1/7500頭份/mL，耳靜脈注射家兔2只，1.0 mL/只，觀察96 h。

2 結果

2.1 半成品檢驗 收獲1～7收各收次毒液，檢測效價，7個收次的病毒液效力均在5.0×106RID/mL以上(如表1)。

表1 各次收獲病毒液的效價 (RID/mL)

7個收次的病毒液按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)附錄進行純凈性檢驗，無細菌、真菌、支原體生長和外源病毒污染；病毒液對豬安全無副作用。

2.2 疫苗成品的安全和效力檢驗 接種疫苗后觀察21日，所有試驗豬體溫、精神、食欲無明顯變化，無異常臨床反應，疫苗安全檢驗合格。

家兔接種疫苗后觀察4 d，2只家兔1只為定型熱(++)，另1只為輕熱(+)，疫苗效力檢驗合格。

3 討論

應用生物反應器培養ST細胞生產豬瘟病毒能實現細胞高密度生長，本研究建立了一種規模化培養豬瘟活疫苗生產工藝，通過將已感染豬瘟病毒的細胞直接接種至反應器進行培養，收獲病毒液，縮短了生產周期，充分利用了轉瓶中可帶毒傳代的優勢，而且自動化水平較高，生產過程穩定可控，降低了產品批間差異，有利于穩定產品質量。

建立的豬瘟病毒生產工藝一個周期病毒收獲量至少與600個轉瓶的單次收獲量相當，該工藝與原有的轉瓶生產工藝相比，培養時間縮短一半，大大提高了生產效率，對于穩定產品質量，降低生產成本有明顯優勢。

采用兔體熱反應和間接免疫熒光兩種方法對半成品毒液進行了抗原含量檢測，根據檢測結果可以看出兩者之間呈正相關關系，應用間接免疫熒光方法檢測抗原含量有很大的可行性。

[1] 張雙, 郭慧, 徐浩，等.新型豬瘟疫苗的研究進展[J].中國獸醫雜志, 2015, 51(1): 72-74.

[2] 康愷, 林鷙, 高海慧，等, 豬瘟病毒促進細胞自噬并利于病毒增殖[J], 畜牧獸醫學報, 2014, 45(9): 1481-1487.

[3] 李安. 豬瘟病毒強毒株與疫苗C株鑒定方法的建立及疫苗病毒定量檢測的研究[D], 泰安：山東農業大學, 2010.

[4] 鄭朝朝. 脾毒有效期對豬睪丸細胞產豬瘟毒的影響.第四屆京津冀一體化畜牧獸醫科技創新研討會論文集[S], 石家莊：2014年6月.

[5] 鄭朝朝, 邱貞娜,柳珊.等, 激流灌注式生物反應器培養豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(R98株)工藝的研究[J].中國預防獸醫學報, 2013.35(2):107-109.

2016-02-24

郁宏偉(1978-)，男，獸醫師，博士，主要從事動物用生物制品研究與開發，E-mail: yuhongwei2005@126.com

鄭朝朝，E-mail: zhengzhao521@163.com

S852.612

B

0529-6005(2017)02-0095-02