丁香葉黃酮對小鼠藥物性肝損傷的保護作用研究

趙常偉 ， 劉芳萍 ， 左詠梅 ， 馬 欣 ， 常軼聰 ， 李 睿 ， 李敏敏 ，赫景姍 ， 史晨曦 ， 李 植 ， 藺月霞 ， 韓 晴 ， 李繼昌 ， 高 利

(1.東北農業大學動物醫學學院， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2. 黑龍江省動物衛生監督所， 黑龍江哈爾濱150001)

丁香葉黃酮對小鼠藥物性肝損傷的保護作用研究

趙常偉1， 劉芳萍1， 左詠梅2， 馬 欣1， 常軼聰1， 李 睿1， 李敏敏1，赫景姍1， 史晨曦1， 李 植1， 藺月霞1， 韓 晴1， 李繼昌1， 高 利1

(1.東北農業大學動物醫學學院， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2. 黑龍江省動物衛生監督所， 黑龍江哈爾濱150001)

為確定丁香葉黃酮的保肝作用，將小鼠隨機分為5組，即對照組、模型組、丁香葉黃酮高劑量組(40 mg/kg體重)、中劑量組(35 mg/kg體重)、低劑量組(30 mg/kg體重)，以血清轉氨酶(ALT、AST)、肝組織指標(MDA、NO、SOD、GSH、GSH-Px)及II相藥物代謝酶GSTA1為檢測對象，結合小鼠肝臟病理變化綜合分析。結果顯示，丁香葉黃酮高劑量組血清轉氨酶和肝組織中MDA、NO均極顯著降低(P<0.01)，SOD、GSH、GSH-Px均極顯著升高(P<0.01)，GSTA1的含量也極顯著升高(P<0.01)；肝臟組織病理學顯示脂肪變性、壞死及炎性細胞浸潤減輕；而中、低劑量組的各指標和組織學變化均不如高劑量組明顯。研究表明，丁香葉黃酮以40 mg/kg體重劑量對小鼠藥物性肝損傷有較好的保護作用。

丁香葉黃酮 ； 醋氨酚 ； 肝損傷 ； GSTA1 ； 小鼠

丁香葉性寒，味苦，入肝、膽、胃三經，有解毒消炎、燥濕、退黃的作用。丁香葉很早在民間就被用作“抗菌消炎、保肝利膽”的良藥[1]。研究表明，丁香葉醇溶液的提取物對大腸桿菌等引起的腸炎、腹瀉有很好的治療作用，其有效成分為黃酮和有機酸類[2]。在近代醫學，提取自不同植物的黃酮類成分被廣泛應用于各種原因導致的肝損傷保護性研究，但沒有關于丁香葉黃酮保肝的研究。對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)又叫醋氨酚，是臨床常用的解熱鎮痛藥，也是臨床重要的非甾體類抗炎藥[3]，由APAP誘導的小鼠急性肝損傷是篩選、研究保肝藥物首選的經典模型[4]。本研究在課題組前期建立的APAP誘導藥物性肝損傷模型的基礎上，開展丁香葉黃酮的保肝作用研究，為丁香葉的深度開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明系小鼠，體重(20±2g)，雄性，清潔級，購自哈藥集團制藥總廠實驗動物中心。

1.2 丁香葉黃酮的提取 按本課題組前期建立丁香葉黃酮的提取方案：取10 g丁香葉細粉置于250 mL容量瓶中，加入120 mL無水乙醇、80 mL水，溫度50 ℃的情況下用超聲波輔助提取30 min后，再回流提取80 min，濾過后用旋轉蒸發儀在60 ℃旋蒸至適量體積，70 ℃真空干燥測得其中的丁香葉黃酮1.274 g。按這種方法提取丁香葉黃酮的提取率為12.74%。

1.3 動物分組和給藥 將40只小鼠隨機分為5組，即對照組，模型組，丁香高、中、低(40 mg/kg體重、35 mg/kg體重、30 mg/kg體重)劑量組，對照組和模型組給予等體積生理鹽水。第7天末次給藥后禁食12 h，對對照組，各組小鼠分別以APAP溶液200 mg/kg灌胃(按0.1 mL/10 g體重)。禁食不禁水12 h后，將小鼠眼球采血分離血清測定ALT、AST，摘取肝臟，取部分組織制作肝臟病理切片，其余組織用勻漿后測定MDA、GSH、GSH-Px、NO、SOD以及GSTA1。

1.4 各指標的檢測方法 ALT、AST、MDA、GSH、GSH-Px、NO、SOD均采用南京建成生物研究所試劑盒，用紫外可見分光光度計(型號UV1901PC)測定。

1.5 GSTA1含量的測定 GSTA1含量測定是采用小鼠谷胱甘肽S轉移酶A1 ELISA試劑盒(美國Rapidbio公司生產)試劑盒，用Bio-Rad iMarkTM型酶標檢測儀測定，在450 nm有最大吸收值，根據標準曲線和蛋白濃度計算樣品中GSTA1含量。

1.6 肝臟病理組織學分析 用福爾馬林固定組織標本后，經過脫水、透明、包埋處理，將包埋好的組織塊切成5 mm的厚度。按H.E.染色的常規步驟用蘇木精-伊紅染色，在光鏡下進行肝組織的形態學觀察。

1.7 統計方法 采用 SPSS19.0軟件進行單因素方差分析(Dunnett′s法統計分析)。

2 結果

2.1 小鼠血清中轉氨酶ALT、AST活性的變化 小鼠血清中轉氨酶ALT、AST活性的變化見表1，與對照組比較，模型組小鼠血清中的ALT、AST極明顯增高 (P<0.01)，表明模型復制成功。與模型組相比，丁香葉黃酮高劑量組的ALT、AST極明顯降低(P<0.01)，說明40 mg/kg體重丁香葉黃酮可以顯著降低APAP肝損傷模型中血清轉氨酶的活性。

表1 小鼠血清ALT、AST活性的變化

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01，下表同

2.2 小鼠肝組織指標MDA、NO、GSH-Px、SOD、GSH的變化 小鼠肝組織指標MDA、NO、GSH-Px、SOD、GSH的變化見表2，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中NO、MDA極顯著增高(P<0.01)，GSH-Px、SOD、GSH極顯著降低(P<0.01)，表明模型復制成功；與模型組相比，丁香葉黃酮高劑量組的NO、MDA極顯著降低(P<0.01)，GSH-Px、SOD、GSH極顯著升高(P<0.01)。說明40 mg/kg體重丁香葉黃酮可以明顯改善APAP所造成的肝組織的損傷。

表2 小鼠肝組織中NO、MDA、GSH-Px、SOD、GSH變化

MDA(nmol/mgprot)NO(nmol/gprot)GSH?Px(U/mgprot)SOD(U/mgprot)GSH(gGHS/L)對照組2．72±0．610．84±0．161380．12±94．8787．87±1．4817．24±1．07模型組4．82±0．66??1．31±0．13??557．88±76．32??57．36±1．29??7．92±0．92??丁香葉黃酮高劑量組(40mg/kg體重)3．51±0．78▲▲0．95±0．03▲▲1077．54±99．88▲▲81．05±1．35▲▲16．49±1．30▲▲丁香葉黃酮中劑量組(35mg/kg體重)5．72±0．39▲▲1．11±0．05▲▲545．86±77．6667．44±1．62▲▲15．13±1．10▲▲丁香葉黃酮低劑量組(30mg/kg體重)6．40±0．461．14±0．04▲417．74±94．24▲58．77±1．248．84±0．49

2.3 小鼠肝組織中GSTA1含量的變化 小鼠肝組織中GSTA1含量的變化見封三彩版圖1，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中GSTA1含量極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，丁香葉黃酮高劑量組GSTA1含量極顯著升高(P<0.01)，說明40 mg/kg體重丁香葉黃酮可以明顯增加APAP肝損傷模型中肝組織內GSTA1的含量，GSTA1的變化趨勢與GSH-Px、SOD、GSH相一致。

2.4 小鼠肝組織病理學分析 小鼠肝臟病理學切片如封三彩版圖2所示： APAP模型組(圖b和圖c)脂肪變性，細胞核裂解、消失，嗜酸性變和炎性細胞浸潤；丁香葉黃酮高劑量組(圖d)脂肪變性、壞死及炎性細胞浸潤減少，說明肝組織受到了保護；中劑量組(圖e)也有一定的保肝作用。

3 討論

研究表明黃酮類化合物對不同類型的試驗性肝損傷均有不同程度的保護作用。這種保護作用與黃酮類化合物抗氧化、清除自由基、調節免疫等功能等有關。目前研究肝損傷的常用有血清轉氨酶和肝組織指標。本課題組前期研究發現，II相藥物代謝酶GSTA1可以作為肝損傷模型的早期診斷指標[5]，因此，本研究也以GSTA1作為丁香葉黃酮保肝作用的評價指標之一。這些指標的變化揭示了APAP打破了肝組織內氧化和抗氧化的平衡。

ALT/AST是反映肝細胞變性損傷情況的常規檢測指標。本試驗中，模型組ALT和AST極顯著升高，且AST/ALT>1，說明模型組肝損傷明顯。而丁香葉黃酮高劑量組AST/ALT<1，再次驗證了丁香葉黃酮對肝損傷的保護作用。APAP造模對肝臟的損傷使肝細胞內的線粒體遭到嚴重破壞，AST從線粒體中釋放，而丁香葉黃酮可以保護肝細胞內線粒體的損傷[5]。GSH是解除毒素的特效物質，它作為體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可以與自由基、重金屬等結合，從而把機體內有害的毒物轉化為無害的物質排泄出體外；SOD是機體在正常生理狀況下惟一能夠清除氧自由基的酶，GSH-Px也是谷胱甘肽氧化還原循環中催化GSH氧化的主要酶之一；NO是機體中一種極不穩定的生物自由基；MDA作為脂質過氧化物的終產物具有很強的細胞毒性，其變化可以間接反映出由自由基損傷機體引發出的脂質過氧化的情況。本試驗中，丁香葉黃酮高劑量組的GSH、SOD、GSH-Px、MDA、NO的變化說明丁香葉黃酮可以促使肝組織內清除脂質自由基、維持肝細胞的正常功能、排除毒素等。GSTA1是Ⅱ相酶GST的一個亞型，在編碼的二聚體蛋白過程中，是機體抗氧化防御系統的重要組成部分，可以催化許多外源性化學物與GSH結合，促進其在細胞內降解清除，達到保護肝臟的目的[6]。本試驗中，GSTA1含量的變化說明模型組肝組織內自由基增多、氧化程度明顯，而丁香葉黃酮高劑量組肝組織內自由基數量減少，氧化程度減輕，肝細胞膜系統的損傷程度降低，肝臟中GSTA1含量的升高對肝損傷具有保護意義。

本研究表明，丁香葉黃酮對APAP誘導小鼠急性肝損傷有良好的保護作用。在小鼠急性肝損傷時，肝臟中的GSTA1含量呈規律性變化，結合血清轉氨酶、肝組織指標及肝組織病理學變化，確定丁香葉黃酮的保肝劑量為40 mg/kg體重。本研究為保肝藥物的開發及肝損傷機制的進一步探究提供依據。

[1] 郝婷婷. 治療肝炎新藥-紫丁香葉的研究[D]. 長春: 吉林農業大學, 2008.

[2] 王潔, 王冬梅, 齊富剛,等. 丁香葉提取物對豬源性大腸桿菌的抑菌作用研究[J]. 飼料工業, 2015，36(14):11-13.

[3] Liu F, Lin Y, Li Z,etal. Glutathione S-transferase A1 (GSTA1) release, an early indicator of acute hepatic injury in mice[J]. Food and Chemical Toxicology, 2014, 71: 225-230.

[4] 劉芳萍, 周瓊, 劉穎姝,等. APAP致小鼠急性藥物性肝損傷模型建立方法的研究[C]// 中國毒理學會獸醫毒理學與飼料毒理學學術討論會暨獸醫毒理專業委員會第4次全國代表大會會議論文集，北京：中國毒理學會，2012.

[5] Chang Y C, Liu F P, Ma X,etal. Glutathione S-transferase A1-a sensitive marker of alcoholic injury on primary hepatocytes, Human & Experimental Toxicology, sagepub[J].co uk/journalsPermissions.navDOI: 2016,10.1177/0960327116650013.

[6] Liu F P, Ma X, Li M M,etal. Hepatoprotective effects of Solanum nigrum against ethanol-induced injury in primary hepatocytes and mice with analysis of glutathione S-transferase A1[J]. Journal of the Chinese Medical Association, 2016,79:65-71.

Study on protective effects of flavonoids in folium syringaeon drug hepatic injury in mice

ZHAO Chang-wei1, LIU Fang-ping1, ZUO Yong-mei2, MA Xin1, CHANG Yi-cong1, LI Rui1,LI Min-min1,HE Jing-shan1, SHI Chen-xi1, LI Zhi1, LIN Yue-xia1, HAN Qing1, LI Ji-chang1, GAO Li1

(1.College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2.Animal Health Supervision Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150001，China)

To determine the protective effect of flavonoids on folium syringae, mice were randomly divided into 5 groups including control, model, folium syringae high, middle and low dose groups. Serum transaminases (ALT, AST), liver index (MDA, NO, SOD, GSH, GSH-Px) and GSTA1 were analyzed as detection indicators, and tissues were also collected for histopathology.The results showed that serum transaminases, MDA and NO were significantly reduced (P<0.01), and SOD, GSH, GSH-Px and GSTAI were significantly increased (P<0.01).In addition hepatic tissue, fat degeneration, necrosis and inflammatory cell infiltration were reduced in high dose group, while all the changes were less in middle and low dose groups.These results suggest that the folium syringae flavonoids has a protective effect on mice from drug hepatic injury at 40 mg/kg dose.

folium syringae flavonoids; hepatic injury; GSTA1; APAP; mice

LIU Fang-ping

2016-06-29

國家自然科學基金(31472241)；黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目(PC13S03)

趙常偉(1989-)，男，碩士生，主要從事獸醫藥理學與毒理學研究，E-mail: 1211164846@qq.com

劉芳萍，E-mail：fangpingliu@126.com

S859.7

A

0529-6005(2017)02-0090-03