20味中藥對奶牛隱性乳房炎3種病原菌體外抑菌效果比較

郝景鋒， 李靜姬， 張宇航， 尹柏雙， 付連軍， 黃 巖， 李心慰， 李小兵， 趙晨旭， 劉國文

(1.吉林農業科技學院動物科技學院 ， 吉林吉林132101 ； 2.吉林大學動物醫學學院 ， 吉林長春130062)

20味中藥對奶牛隱性乳房炎3種病原菌體外抑菌效果比較

郝景鋒1， 李靜姬1， 張宇航1， 尹柏雙1， 付連軍1， 黃 巖1， 李心慰2， 李小兵2， 趙晨旭2， 劉國文2

(1.吉林農業科技學院動物科技學院 ， 吉林吉林132101 ； 2.吉林大學動物醫學學院 ， 吉林長春130062)

為了研究蒲公英、魚腥草等20味中藥對從隱性乳房炎奶牛乳汁中分離的大腸桿菌、鏈球菌以及金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果，試驗采用打孔法和試管二倍稀釋法進行了體外抑菌試驗以及測定其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。試驗結果表明，蒲公英、魚腥草、益母草、紅花、金銀花等5味中藥對奶牛隱性乳房炎3種病原菌的綜合抑制效果較好，達到了極度敏感或高度敏感，試驗表明，蒲公英、魚腥草、益母草、紅花、金銀花在一定程度上可作為治療奶牛隱性乳房炎的首選藥物。

奶牛隱性乳房炎； 中草藥； 體外抑菌

奶牛乳房炎在中獸醫中被稱為乳癰，是痰、濕、氣、血郁結不散，在生產中對奶牛養殖業危害巨大，每年造成巨大的經濟損失，一度成為制約奶牛養殖業健康發展的瓶頸，而奶牛隱性乳房炎在我國發病率高達70%以上，抗生素治療奶牛乳房炎在一定程度上取得了較大成功，但其副作用亦十分明顯，對機體損傷巨大，嚴重破壞機體內環境菌群平衡，在機體內殘留較大而嚴重破壞乳的質量，更嚴重的是由此而引起的細菌耐藥性，中藥治療奶牛乳房炎很好地克服以上弊端，我國中藥資源豐富，中醫理論博大精深，因此中藥治療奶牛乳房炎勢在必行[1]。本試驗通過對吉林省某奶牛場隱性乳房炎奶牛中分離、純化并經鑒定的致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌進行體外抑菌效果研究，旨在了解隱性乳房炎致病菌的耐藥性，篩選出具有抑制引起乳房炎細菌感染的中藥，為利用中藥科學防控奶牛乳房炎提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)中藥：益母草、紅花、金銀花、地丁、肉桂、蒼術、香附、積實、黃連、黃芪、黃柏、苦參、穿心蓮、川芍、桃仁、當歸、黨參、黃芩、蒲公英、魚腥草共20味中藥，均采購自吉林省吉林市重慶路大藥房；(2)菌株：奶牛隱性乳房炎病原菌大腸桿菌、鏈球菌以及金黃色葡萄球菌來自于吉林省某牛場，由吉林農業科技學院動物科技學院微生物實驗室分離、純化并鑒定，4 ℃保存，備用。

試驗器材與試劑：常規培養基：綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養基，購自上海研生實業有限公司；麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基，購自青島海博生物技術有限公司；疊氮鈉血培養基、甘露醇高鹽瓊脂培養基，購自江蘇晶美生物科技有限公司；普通營養瓊脂培養基、營養肉湯按常規方法配制。

主要儀器：超凈工作臺(型號為SW-CJ-2D)，南京萊步科技實業有限公司生產；旋轉蒸發儀(型號為RE100-Pro)，杭州大衛科教儀器有限公司生產；恒溫培養箱(型號為BS-1E)，常州市萬豐儀器制造有限公司生產；SANYO全自動滅菌鍋(型號為MLS-3750)，上海復昌科技有限公司生產；電子分析天平(型號為FA1004)，北京京科瑞達科技有限公司生產；電熱恒溫水浴鍋(型號為DC-3020)，寧波市雙嘉儀器有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗菌液的制備 將本試驗保存的經臨床分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于普通營養瓊脂平板，37 ℃培養 20 h，鏈球菌接種于綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養基，37 ℃培養24 h，挑選典型菌落，分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于 5 mL普通營養肉湯中，鏈球菌接種于 5 mL(含50 mL/L綿羊鮮血)的營養肉湯中，37 ℃培養24 h后，用0.5個麥氏比濁度比濁，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌用普通營養肉湯稀釋，鏈球菌用含50 mL/L綿羊鮮血的營養肉湯中的營養肉湯稀釋，均稀釋至 1×105CFU/mL，備用。

1.2.2 試驗中藥液制備 以電子分析天平精確稱取蒲公英、魚腥草等20味中藥各30 g，粉碎過75目篩，于300 mL五餾水中侵泡45 min后，加熱至沸騰后改用文火煎煮1h，用8層紗布過濾，濾渣加300 mL五餾水侵泡45 min后，加熱至沸騰后改用文火煎煮1h，棄去濾渣，合并兩次濾液，藥液經抽濾后置旋轉蒸發儀上濃縮，最終制成 1∶1 的流浸膏，1 mL流浸膏相當于原藥材 1 g(g/mL)，100 ℃ 煮沸滅菌，4 ℃ 保存備用。

1.2.3 體外抑菌試驗 體外抑菌試驗采用打孔法[2]，分別將1∶500稀釋的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌0.10 mL以及1∶50稀釋鏈球菌0.10 mL用涂菌棒將菌液均勻涂抹于培養基表面，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于普通營養瓊脂平板，鏈球菌接種于綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養基，37 ℃培養 24 h，在涂菌的瓊脂培養基上用直徑6 mm的打孔器均勻打孔,在空中以無菌條件添加制備的各種中藥藥液0.10 mL，37 ℃培養24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小(mm)，數據結果處理方法采用5次試驗的平均值±標準誤表示。判定標準：抑菌圈直徑在20 mm以上為極度敏感；抑菌圈直徑在10～20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑在6～10 mm為中度敏感；無抑菌圈為耐藥。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)測定 最小抑菌濃度(MIC)測定采用試管二倍稀釋法[3]進行操作，取嚴格消毒的試管12支并編號，分別加入0.10 mL普通營養肉湯(用于培養大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)和0.10 mL(50 mL/L綿羊鮮血)的營養肉湯(用于培養鏈球菌)，在1號試管加入藥液0.10 mL，混勻，吸取0.10 mL加入2號試管，依次操作，10號試管吸取0.10 mL棄去，形成藥物濃度依次為(0.500，0.250，0.125，0.063，0.032，0.016，0.008，0.004，0.002，0.001 mg/mL)，11號試管不加病原菌作為陰性對照，12號試管不加藥液作為陽性對照，加完藥液后密封，37 ℃恒溫培養24 h測定數據。

1.2.5 最小殺菌濃度(MBC)測定 分別吸取0.10 mL上述中藥藥液在 MIC 以上還未見細菌生長的各孔培養物，移至普通瓊脂培養基(用于培養大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)或含50 mL/L綿羊鮮血的營養瓊脂培養基(用于培養鏈球菌)上，用無菌接種棒劃線培養，37 ℃恒溫培養24 h，觀察有無細菌生長，菌落數少于5個為該中藥的MBC值[4]。

2 試驗結果

2.1 體外抑菌試驗結果 體外抑菌試驗結果見表1，大腸桿菌對益母草、紅花、金銀花、蒲公英以及魚腥草極度敏感；對黃柏、苦參、穿心蓮和黨參高度敏感；對地丁、肉桂、蒼術、香附、黃芩、黃連以及黃芪中度敏感；對枳實不敏感；金黃色葡萄球菌對益母草、紅花、金銀花、黃柏、苦參、穿心蓮、蒲公英以及魚腥草極度敏感；對地丁、黃連和黃柏高度敏感；對肉桂、香附、枳實、川芍、桃仁、當歸和黨參中度敏感；對黃芩不敏感；鏈球菌對益母草、紅花、金銀花、蒲公英和魚腥草極度敏感；對黃連、穿心蓮和黃芩高度敏感；對地丁、黃芪、黃柏和苦參中度敏感，對蒼術和當歸不敏感。

表1 20味中藥對奶牛隱性乳房炎3種病原菌體外抑菌效果 /mm

2.2 MIC測定的結果 MIC測定的結果見表2，對大腸桿菌作用效果最好的是蒲公英、益母草、紅花以及魚腥草，MIC分別為32、63、63 mg/mL以及 63 mg/mL；對金黃色葡萄球菌作用效果最好的是金銀花、益母草、紅花、蒲公英和魚腥草，MIC分別為63、63、63、125 mg/mL和125 mg/mL；對鏈球菌作用效果最好的是益母草、紅花、蒲公英、金銀花和魚腥草，MIC分別為32、32、63、63 mg/mL以及63 mg/mL。

表2 20味中藥對奶牛隱性乳房炎3種病原菌的最小抑菌濃度 (mg/mL)

2.3 MBC測定的結果 MBC測定的結果見表3，對大腸桿菌作用效果最好的是蒲公英、魚腥草、益母草以及紅花，MBC分別為63、63、125 mg/mL以及125 mg/mL；對金黃色葡萄球菌作用效果最好的是金銀花、益母草、紅花、蒲公英和魚腥草，MBC均為125 mg/mL；對鏈球菌作用效果最好的是益母草、蒲公英、金銀花、魚腥草以及紅花，MBC分別為63、63、63、63 mg/mL以及125 mg/mL。

3 討論與分析

3.1 中藥對奶牛乳房炎分離菌的體外抑制作用 中獸醫學認為奶牛乳房炎即乳癰，是痰、濕、氣、血郁結不散，化而為炎。飼養管理不善，久臥濕熱之地，濕熱毒氣上溢，濕邪入侵乳房；胃中熱邪熾盛，肝氣郁滯，氣血紊亂,蘊結乳房,乳絡阻塞而生癰腫；犢牛吸乳時咬破乳頭，邪毒入侵引起癰腫；患牛拒絕擠奶，乳汁瘀滯，乳房脹滿等均可導致本病。很多中藥都有抑菌、抗菌作用，有的療效甚至優于抗生素[5]。所以，從中藥中尋找治療奶牛乳房炎的抗生素替代物已成為未來發展的方向，我國地大物博，中藥資源豐富，而且中藥具備地域性特點，中醫理論博大精深，對奶牛乳房炎研究歷史悠久，積累了寶貴的診療經驗，中藥具有對機體損傷小、毒副作用小、不易產生抗藥性、殘留少、不破壞奶牛產品營養成分等特點，能夠保證動物性食品安全，研究表明，中藥含有多種活性物質，對感染的病原菌具有明顯的殺菌域抑菌作用，從而達到防治該病的目的[6]。蒲公英性味：苦甘，寒，可入肝經、胃經，具備清熱解毒，利尿散結之功效；魚腥草味辛，性寒涼，歸肺經，能清熱解毒、消腫療瘡、利尿除濕、清熱止痢、健胃消食，用治實熱、熱毒、濕邪、疾熱等；益母草味辛苦、涼，活血、祛淤、消水，治療胎漏難產、胎衣不下、瘀血腹痛、癰腫瘡瘍等癥；紅花性味：辛、溫，入心、肝經，能活血通經，散瘀止痛，有助于治瘀滯腹痛、瘡瘍腫痛療效；金銀花性寒，味甘，入肺、心、胃經，具有清熱解毒、抗炎功效，主治脹滿下疾、溫病發熱，熱毒癰瘍等癥。因此蒲公英、魚腥草、益母草、紅花和金銀花對奶牛隱性乳房炎主要致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌體外抑菌效果很好，理論上可以作為奶牛乳房炎治療首選中藥。

表3 20味中藥對奶牛隱性乳房炎3種病原菌的最小殺菌濃度 (mg/mL)

注：數據結果采用5次試驗的平均值±標準誤表示

3.2 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)

從最小抑菌濃度以及最小殺菌濃度試驗結果來看，大腸桿菌對益母草、紅花、魚腥草、金銀花以及蒲公英極度敏感，蒲公英、魚腥草、益母草MBC值達到63 mg/mL，以上幾味中藥均可入肝經以及胃經，治療癰腫瘡瘍均有較好效果，均有一定驅濕邪之功效，這與崔一喆[7]報道的魚腥草、金銀花以及蒲公英對奶牛乳房炎大腸桿菌抑菌效果良好一致；金黃色葡萄球菌對金銀花、益母草、紅花、蒲公英和魚腥草極度敏感，MIC達到125 mg/mL；鏈球菌對益母草、蒲公英、金銀花、魚腥草極度敏感，MBC值達到63 mg/mL，對桃仁、當歸、黨參以及黃芩抑菌效果較差，與吳國娟[8]報道的結果不同，可能與本試驗的當歸、黨參等中藥水提法有關，可能與當歸等中藥的水溶性有一定關系，有待于進一步分析。從試驗研究結果可以認為蒲公英、魚腥草、益母草、金銀花以及紅花對奶牛乳房炎主要致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌均有較好的抑菌、殺菌作用，奶牛乳房炎治療應以清熱解毒、抗菌消炎、通經活血、消腫止痛、活絡通乳為依據，因此可以考慮復方中藥治療奶牛乳房炎的可能性。本研究為體外抑菌效果比較，尚不可作為治療奶牛乳房炎的依據，具體效果應以臨床試驗效果加以驗證，本研究成果可為臨床奶牛隱性乳房炎治療提供理論基礎和依據。

4 小結

經體外抑菌試驗、MIC以及MBC值測定，蒲公英、魚腥草、益母草、紅花和金銀花對奶牛隱性乳房炎主要致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌顯示出很好的抑菌、殺菌效果，在臨床上以上幾味中藥可以作為治療奶牛隱性乳房炎的優選藥物。

[1] 畢海林，唐達，唐建華.奶牛乳房炎的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫，2012(11)：27-29.

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[4] 付秀花，王恬.中草藥對奶牛乳房炎病原菌的體外抑菌試驗[J].動物科學與動物醫學，2002，19(5)：16-19.

[5] 孟慶娟.中藥復方灌注劑對奶牛乳房炎的防治效果及作用機理的研究田[D].合肥：安徽農業大學，2011.

[6] 關宇晶，侯振中.奶牛乳房炎防治研究進展[J].飼料博覽，2013(8)：49-51.

[7] 崔一喆，張秀英，王秋菊.中草藥對奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果[J].中國獸藥雜志，2006，40(6)：28-30.

[8] 吳國娟，張中文，李煥榮，等.中草藥對奶牛乳房炎6種致病菌的抑菌效果觀察[J].北京農學院學報，2003，18(3)：195-198.

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2016-03-18

吉林省科技廳重點科技攻關項目(20150204024NY)

郝景鋒(1977- )，男，副教授，博士生，從事臨床獸醫學教學及研究，E-mail：jlhjf2012@163.com

劉國文，E-mail：gwliu@jlu.edu.cn

S853.72

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0529-6005(2017)02-0055-03