雙重?zé)晒猸h(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增檢測猴空腸彎曲桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌

盤寶進(jìn) ， 溫和心， ， 龍英全 ， 蔣榮華 ， 陳立軍 ， 何成偉 ，羅 佳

(1.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心， 廣西南寧530021；2.貴港出入境檢驗檢疫局， 廣西貴港537100 ； 3.憑祥出入境檢驗檢疫局， 廣西憑祥530002)

雙重?zé)晒猸h(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增檢測猴空腸彎曲桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌

盤寶進(jìn)1， 溫和心1，2， 龍英全2， 蔣榮華2， 陳立軍1， 何成偉3，羅 佳1

(1.廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心， 廣西南寧530021；2.貴港出入境檢驗檢疫局， 廣西貴港537100 ； 3.憑祥出入境檢驗檢疫局， 廣西憑祥530002)

本試驗在環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增體系引入分子信標(biāo)建立雙重?zé)晒猸h(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增方法，利用該方法檢測實驗猴空腸彎曲桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，結(jié)果敏感性分別達(dá)到10-2CFU/mL和10-3CFU/mL，與常見腸道菌無交叉反應(yīng)。

雙重?zé)晒猸h(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增 ； 檢測 ； 空腸彎曲桿菌 ； 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌

空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni，CJ)和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica，YE)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患病的病原菌，主要引起人類的急性腸炎。空腸彎曲桿菌已經(jīng)取代沙門菌成為發(fā)達(dá)國家最常見的腹瀉病病原菌之一，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌能在冷藏溫度下(0 ℃～4 ℃)生長繁殖，俗稱“冰箱菌”，國外已將兩種菌列為進(jìn)口實驗動物檢疫項目[1]。當(dāng)前我國兩種菌的檢疫標(biāo)準(zhǔn)采用培養(yǎng)鑒定法[2-3]，CJ菌培養(yǎng)條件苛刻，微需氧菌，曝露在空氣中過久(國標(biāo)要求不超過0.5 h)細(xì)菌會死亡，培養(yǎng)成功率低。YE菌檢驗要經(jīng)過低溫增菌，該法耗時長，需要1周時間。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有擴(kuò)增效率高、設(shè)備簡單等優(yōu)勢。分子信標(biāo)能與DNA擴(kuò)增產(chǎn)物特異結(jié)合，不同熒光素標(biāo)記的探針可以實現(xiàn)多重項目檢測。本試驗是在環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)體系中引入分子信標(biāo)，分子信標(biāo)環(huán)部與LAMP產(chǎn)物環(huán)部特異結(jié)合后，莖部打開發(fā)出熒光信號，最終實現(xiàn)雙重?zé)晒釲AMP檢測CJ菌和YE菌DNA，顯著縮短了檢測時間。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 DNA大片段聚合酶試劑盒(廣州華鋒公司)，脫氧核苷酸(Invitrogen)，羥基萘酚藍(lán)(HNB，AR，Sigma)，甜菜堿(AR，Sigma)，硫酸鎂(AR，Sigma)，礦物油(Merk)，LAMP引物、分子信標(biāo)，TaqMan探針均由TaKaRa合成，標(biāo)準(zhǔn)菌株(廣東環(huán)凱公司)。

熒光PCR儀(ABI 7500)，水浴鍋(上海一恒，HWS24)，離心機(jī)(Sigma 2-16PK)、電泳儀(北京六一，DDY-2C)，凝膠成像系統(tǒng)(WD-9403D，北京六一)，移液器(Ependorf)，生化培養(yǎng)箱(上海實驗儀器廠，SHP-180)；超純水系統(tǒng)(Milli-Q)。

1.2 菌株培養(yǎng)計數(shù) CJ菌培養(yǎng)條件為42 ℃微需氧環(huán)境(85% N2、10% CO2、5% O2)，用Mueller-Hinton(MH)液體培養(yǎng)基過夜，取菌液系列稀釋，涂布于Mueller-Hinton(MH)固體培養(yǎng)基中，24 h計算菌落數(shù)。YE菌用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)過夜，菌液用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)計數(shù)，培養(yǎng)條件為37 ℃需氧環(huán)境。

1.3 LAMP引物與分子信標(biāo)設(shè)計

1.3.1 LAMP引物設(shè)計 Primerexplorer V 4.0在線軟件針對YE菌基因設(shè)計若干組引物，含內(nèi)引物(F3、B3)、外引物(FIP、BIP)。對合成的引物進(jìn)行LAMP試驗，選定反應(yīng)性、特異性、敏感性高的引物組。

表1 LAMP引物

1.3.2 分子信標(biāo)設(shè)計 信標(biāo)莖區(qū)序列均為：CCGGCG(Tm 65 ℃)，CJ菌5′端標(biāo)記Cy5，YE菌5′端標(biāo)記FAM，3′端均標(biāo)記淬滅基團(tuán)DABCYL。分子信標(biāo)環(huán)區(qū)與LAMP產(chǎn)物的啞鈴環(huán)區(qū)結(jié)合，通過增減環(huán)區(qū)序列堿基長度，分別設(shè)計含梯度融鏈溫度(Tm)環(huán)區(qū)的3個分子信標(biāo)。見表2。

表2 分子信標(biāo)環(huán)部設(shè)計

1.4 反應(yīng)體系

1.4.1 基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系 Bst酶緩沖液(10×)2.5 μL，Bst酶(8 U/μL)1 μL，引物(各引物濃度均20 μmol/L，F(xiàn)3：B3：FIP：BIP =1∶1∶8∶8)4.5 μL，dNTP(10 mmol/L each)3.5 μL，MgSO4(100 mmol/L)1.5 μL，betaine(5 mol/L)4 μL，DNA模板1 μL，加dH2O至25 μL。反應(yīng)程序：65 ℃水浴1 h，80 ℃水浴2 min終止反應(yīng)。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增情況。

1.4.2 可視化LAMP反應(yīng)體系 即在基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系上加入HNB((2 mmol/L)至終濃度為 150 μmol/L，加dH2O至25 μL。反應(yīng)結(jié)束后目測反應(yīng)液由深藍(lán)色變成藍(lán)綠色判為陽性，深藍(lán)色無變化判為陰性。

1.4.3 熒光LAMP反應(yīng)體系 即在基礎(chǔ)LAMP反應(yīng)體系上加入分子信標(biāo)至終濃度為0.4 mmol/L，加dH2O至25 μL，在熒光PCR儀上擴(kuò)增讀取熒光信號。

1.5 熒光LAMP反應(yīng)程序的優(yōu)化 等溫模式，即LAMP擴(kuò)增和分子信標(biāo)結(jié)合均維持恒定65 ℃，擴(kuò)增1 min，信標(biāo)結(jié)合10 s后讀取熒光信號，共40個循環(huán)。分別試驗CJ菌和YE菌各Tm值信標(biāo)在LAMP反應(yīng)性能。變溫模式，即LAMP在65 ℃，擴(kuò)增1 min，分子信標(biāo)在較低溫度下退火，10 s后讀取熒光信號，共40個循環(huán)。分別試驗60 ℃、55 ℃、50 ℃、45 ℃3個退火溫度，比較CJ菌和YE菌各Tm值信標(biāo)在各退火溫度LAMP的敏感性。根據(jù)結(jié)果評價兩種反應(yīng)程序的優(yōu)劣，確定熒光LAMP的最優(yōu)反應(yīng)程序。

1.6 雙重?zé)晒釲AMP敏感性與其他分子生物學(xué)方法比較試驗 分別將CJ DNA和YE DNA稀釋成1×106～1×100CFU/mL 6個濃度梯度，進(jìn)行CJ/YE雙重?zé)晒釲AMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果Ct值<35判為陽性。同時對各梯度進(jìn)行電泳法和HNB染料法LAMP反應(yīng)，和PCR、熒光PCR反應(yīng)，與比較各種方法的敏感性。

1.7 雙重?zé)晒釲AMP特異性分析 大腸桿菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、李斯特菌、溶血性鏈球菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌等8種腸道菌標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)(≥106CFU/mL)后熱裂解法提取DNA，加入CJ-YE雙重?zé)晒釲AMP體系進(jìn)行反應(yīng)，鑒定試驗的特異性。

1.8 雙重?zé)晒釲AMP與其他幾種方法檢測樣品符合性試驗采集1 000個試驗猴樣品，每只采4份肛拭子，1份用Mueller-Hinton培養(yǎng)液42 ℃微需氧環(huán)境對CJ菌增菌，1份用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)37 ℃對YE菌增菌，各增菌24 h后，取上層液體1 mL離心棄上清，沉淀用純水反復(fù)洗滌2遍，最后沉淀加100 μL純水復(fù)溶，沸水中煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清分別用于熒光LAMP、顯色LAMP、熒光PCR、PCR方法檢測，同時1份肛拭子按國標(biāo)GB/T 14926.49-2001檢測CJ菌，1份按GB/T 4789.8-2008檢測YE菌。比較以上幾種方法的檢測結(jié)果的符合性。

2 結(jié)果

2.1 CJ、YE菌DNA LAMP電泳法和顯色法試驗結(jié)果 LAMP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，陽性組出現(xiàn)典型的梯狀擴(kuò)增條帶(圖1-A、2-C：1)，而陰性對照未見擴(kuò)增條帶(圖1-A、2-C：2)。顯色法LAMP擴(kuò)增過程中，陽性管顏色逐漸轉(zhuǎn)綠，1小時反應(yīng)結(jié)束后，如圖1-B和2-D，陽性組顏色由深藍(lán)變成藍(lán)綠(圖1-B、2-D：1)，陰性組仍保持深藍(lán)色無變化(圖1-B、2-D：2)。以上結(jié)果充分表明所設(shè)計的2套LAMP引物組能正確擴(kuò)增目標(biāo)DNA，所建立的LAMP反應(yīng)體系有效且穩(wěn)定。

圖1 CJ DNA LAMP電泳法和顯色法試驗結(jié)果

A：CJ DNA LAMP產(chǎn)物電泳； B：CJ DNA可現(xiàn)LAMPM：DNA Marker； 1：CJ DNA； 2：陰性對照

圖2 YE DNA LAMP電泳法和顯色法試驗結(jié)果

C：YE DNA LAMP產(chǎn)物電泳； D：YE DNA可視LAMPM：DNA Marker； 1：YE DNA； 2：陰性對照

2.2 熒光LAMP反應(yīng)程序試驗 65 ℃等溫?zé)晒鈹U(kuò)增CJ DNA和YE DNA，結(jié)果見表3，多數(shù)Tm值的分子信標(biāo)都有不同程度的熒光信號產(chǎn)生，較高Tm值信標(biāo)組敏感性較低Tm值組高，Tm 65 ℃組敏感性最高，CJ DNA和YE DNA最低檢出限分別是104CFU/mL和105CFU/mL，敏感性太差無應(yīng)用價值。Tm 60 ℃組次之，當(dāng)信標(biāo)Tm低至55 ℃時無熒光信號產(chǎn)生。可見等溫?zé)晒釲AMP結(jié)果表明分子信標(biāo)不能高效地與LAMP產(chǎn)物結(jié)合，難以獲得較高的檢測靈敏度。

表3 等溫?zé)晒釲AMP試驗結(jié)果

菌液濃度單位：CFU/mL； +：陽性； -：陰性

變溫?zé)晒鈹U(kuò)增CJ DNA和YE DNA，結(jié)果見表4，在一定退火溫度下，較高Tm值信標(biāo)組熒光敏感性高于較低Tm組。退火溫度低于信標(biāo)環(huán)部Tm值10 ℃～15 ℃時可以獲得較強(qiáng)的熒光信號，低少于10 ℃熒光信號顯著降低，高多于15 ℃則容易產(chǎn)生假陽性。綜合熒光LAMP信標(biāo)和Bst酶的特性，選擇環(huán)部Tm值65 ℃的信標(biāo)，退火溫度50 ℃，熒光LAMP敏感性最高，CJ DNA和YE DNA最低檢出限分別是102CFU/mL和103CFU/mL。

2.3 雙重?zé)晒釲AMP敏感性與其他分子生物學(xué)方法比較試驗結(jié)果 雙重?zé)晒釲AMP敏感性和其他方法比較結(jié)果見表5，雙重?zé)晒釲AMP法檢測CJ DNA和YE DNA的檢出限分別是102CFU/mL和103CFU/mL，敏感性高于LAMP電泳法、顯色法和菌液濃度單位：CFU/mL； FN：False negative，假陰性； FP：Falsepositive，假陽性PCR法，稍低于熒光PCR法。

表4 變溫?zé)晒釲AMP試驗結(jié)果

表5 CJ DNA/YE DNA雙重?zé)晒釲AMP敏感性與其他方法比較結(jié)果

菌液濃度單位：CFU/mL； +：陽性； -：陰性； NC：陰性對照

2.4 雙重?zé)晒釲AMP特異性試驗結(jié)果雙重?zé)晒釲AMP特異性試驗見圖4，只有CJ和YE菌DNA產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號，大腸桿菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、李斯特菌、溶血性鏈球菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌等8種腸道菌未見熒光信號產(chǎn)生，表明該雙重?zé)晒釲AMP對CJ菌和YE菌有較強(qiáng)的特異性。

圖4 雙重?zé)晒釲AMP特異性試驗

2.5 雙重?zé)晒釲AMP與分離培養(yǎng)法、熒光PCR法符合性檢驗對1 000份實驗猴樣品檢測結(jié)果見表6，CJ菌和YE菌的檢測結(jié)果一致表明，各方法檢測敏感性次序是：熒光PCR>熒光LAMP>顯色LAMP≈PCR>分離培養(yǎng)，熒光PCR敏感性最高，熒光LAMP敏感性略低于熒光PCR但高于PCR，分離培養(yǎng)法敏感性顯著低于分子生物學(xué)方法，尤其是CJ菌培養(yǎng)法敏感性更低。

表6 雙重?zé)晒釲AMP與其他方法符合檢驗

3 分析討論

3.1 熒光LAMP分子信標(biāo)的設(shè)計。分子信標(biāo)環(huán)部是一段與LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物環(huán)部DNA互補(bǔ)的一段序列，一般軟件設(shè)計的LAMP引物的擴(kuò)增產(chǎn)物環(huán)部大多在10 bp～25 bp長度，與之對應(yīng)，信標(biāo)環(huán)部一般不超過25 bp，其Tm值多數(shù)處于60 ℃～65 ℃范圍內(nèi)，少見超過68 ℃，雖然高GC含量的序列可獲得更高Tm值，但該類DNA結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以被擴(kuò)增[4]。

3.2 熒光LAMP反應(yīng)程序。Bst酶反應(yīng)的最適溫度是65 ℃，熒光LAMP若在等溫下進(jìn)行，分子信標(biāo)在65 ℃退火，信標(biāo)環(huán)部的Tm值必須比退火溫度高 7 ℃～10 ℃即68 ℃～75 ℃，才能取得理想的退火效果[5]，設(shè)計高Tm值的環(huán)部意味較長序列高GC含量，這是較難實現(xiàn)的，所以選擇65 ℃等溫擴(kuò)增使分子信標(biāo)的設(shè)計困難重重。選擇低于65 ℃溫度擴(kuò)增和退火雖然方便分子信標(biāo)的設(shè)計，但會大幅降低Bst酶的活性，使擴(kuò)增效率降低，選擇高于65℃溫度擴(kuò)增和退火，Bst酶則迅速失活致實驗失敗。由于Bst酶活性溫度和分子信標(biāo)設(shè)計的局限，熒光LAMP選擇變溫模式，即在65 ℃擴(kuò)增，50 ℃下退火，可以有效地解決以上難題，敏感性有大幅提高。與50 ℃退火溫度對應(yīng)，分子信標(biāo)環(huán)Tm值在60 ℃～65 ℃，提高信標(biāo)設(shè)計成功率。

3.3 分離培養(yǎng)法一是肛拭子非目標(biāo)菌量大且雜，目標(biāo)菌被掩蓋，二是由于CJ菌在有氧環(huán)境下易死亡，且培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)成功率不高，從而導(dǎo)致檢出率低，陽性率遠(yuǎn)低于分子生物學(xué)方法。本研究在環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)基礎(chǔ)上引入分子信標(biāo)，通過分子信標(biāo)的設(shè)計和LAMP反應(yīng)程序的優(yōu)化，實現(xiàn)熒光環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增，檢測敏感性雖未達(dá)到熒光PCR水平，但該技術(shù)仍處于研究初級階段，LAMP擴(kuò)增效率理論上達(dá)到109～10拷貝[6]，表明熒光環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)還有較大的提升潛力。

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[2] GB/T14926.49-2001.實驗動物空腸彎曲桿菌檢測方法[S].

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[4] Mamedov T G，Pienaar E，Whitney S E.A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates[J].Comput BiolChem，2008，32(6)：452-457.

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[6] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，etal. Loop-mediated iso?thermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research，2000.

2015-03-06

國家質(zhì)檢總局科研項目(2013IK030)；廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻1347003-8)

盤寶進(jìn)(1966-)，男，研究員，碩士，主要從事動物檢驗檢疫與科研工作，E-mail：295755098@qq.com

R378.2

B

0529-6005(2017)02-0033-04