恒河猴源犬瘟熱病毒N、F基因的克隆與序列分析

邱 薇， 王文博， 胡挺松， 余 靜， 郭 平， 鄭 穎， 張富強， 范泉水

(中國人民解放軍成都軍區疾病預防控制中心 ， 云南昆明650118)

恒河猴源犬瘟熱病毒N、F基因的克隆與序列分析

邱 薇， 王文博， 胡挺松， 余 靜， 郭 平， 鄭 穎， 張富強， 范泉水

(中國人民解放軍成都軍區疾病預防控制中心 ， 云南昆明650118)

為了進一步明確引起恒河猴類麻疹綜合征的病原體及其來源，對恒河猴源犬瘟熱病毒的N、F全基因進行了克隆和序列分析。得到全長1 572 bp的N基因和2 080 bp的F基因，測序后分別與不同CDV毒株的N、F基因核苷酸和氨基酸序列進行分析，N基因核苷酸(氨基酸)與CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、標準野毒株A75-17同源性分別為93.6%(96.9%)、97.3%(99.0%)和97.3%(99.0%)；F基因核苷酸(氨基酸)與上述毒株同源性分別為91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)和94.4%(97.9%)。N、F基因的系統發育分析表明，恒河猴CDV毒株與黑龍江狐貍毒株(CDV-FOX-HLJNM)遺傳關系較近，與其他分離株遺傳關系相對較遠。本研究從分子水平上證明了引起恒河猴發病的病原體為一株CDV野毒株，而非疫苗株。

恒河猴 ； 犬瘟熱病毒 ； N基因 ； F基因 ； 序列分析

The clone and sequence analysis of the N and F genes ofcanine

distemper virus in rhesus monkey

犬瘟熱病毒(CDV)是當前對我國養犬業、毛皮動物養殖業和野生動物保護業危害最大的犬瘟熱的病原，經常引起大批犬、貂、狐等動物發病，病死率30%～80%，雪貂高達100%，經濟損失慘重。隨著生態環境的改變、動物和病毒的進化，CDV自然感染的動物范圍還有不斷擴大的趨勢，尤其是靈長類動物的感染[1-2],使其危害也越來越大。本研究對類麻疹綜合征死亡的恒河猴臟器中擴增的N和F基因進行了克隆和測序分析，進一步明確了引起恒河猴類麻疹綜合征的病原體—犬瘟熱病毒為一株CDV野毒株，而非疫苗株。

1 材料與方法

1.1 材料 CDV弱毒疫苗為日本犬瘟熱病毒疫苗株，本實驗室保存；病料組織取自某動物園死亡的恒河猴肝組織，液氮保存。DH5α由本實驗室保存。

病毒RNA/DNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒、DNA分子量標準、pMD18-T載體，均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產物膠回收試劑盒、質粒(小量)抽提試劑盒，購自上海華舜試劑有限公司；引物合成、純化及測序由上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 引物設計 參照已發表的CHV的N、F基因序列，設計合成兩對引物CDV-C-Nf/r和CDV-C-Ff/r，分別擴增全長N基因和F基因(見表1)。用ddH2O按20 pmol/μL稀釋，-20 ℃凍存。

表1 CDV N基因和F基因RT-PCR及克隆引物

1.3 N、F基因的克隆 采用病毒RNA/DNA提取試劑盒抽提猴肝組織總RNA，以此RNA為模板，用一步法RT-PCR試劑盒及設計合成的引物分別進行RT-PCR，反應體系：10×PCR Buffer 5 μL，MgCl210 μL，dNTP Mixture 5 μL，RNase Inhibitor 1 μL，AMV Reverse Transcriptase XL 1 μL，AMV-OptimizedTaq1 μL，上、下游引物各1 μL，RNA模板5 μL，dH2O 20 μL，總體積50 μL。RT-PCR反應條件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min后，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環，最后72 ℃延伸10 min。取5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，將擴增的PCR產物回收后連接到T載體中。1.4 測序及序列分析 陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序并拼接，應用DNAMAN軟件進行核苷酸和氨基酸序列比對與分析。

2 結果

2.1 CDV N、F基因的擴增 RT-PCR獲得大小分別為1 572 bp和2 080 bp的兩個片段，與N、F全基因理論值相符(見圖1)。

圖1 恒河猴CDV-N/F全基因RT-PCR擴增結果

1：F基因陽性對照； 2：CDV-C-Ff/r； 3：CDV-C-Nf/r陽性對照；4：CDV-C-Nf/r； 5：Vero細胞陰性對照； M：DL-2 000分子量標準

2.2 CDV N、F全基因序列同源性分析 猴源CDV N全基因核苷酸(氨基酸)與CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、標準野毒株A75-17同源性分別為93.6%(96.9%)、97.3%(99.0%)和97.3%(99.0%)，與國內外流行的部分毒株同源性介于92.8%～98.7%(96.9%～100%)之間。F全基因核苷酸(氨基酸)與CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、標準野毒株A75-17同源性分別為91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)和94.4%(97.9%)，與國內外流行的部分毒株同源性介于91.0%～97.4%(96.2%～100%)之間。

2.3 CDV N、F全基因系統發育分析 猴源CDV N/F全基因核苷酸序列與國內外已知代表性毒株序列的系統發育分析結果表明，該CDV毒株與黑龍江(HLJNM)狐貍分離毒株遺傳關系較近，與其他分離株及疫苗株遺傳關系相對較遠(見圖2)。

3 討論

犬瘟熱病毒自然感染的動物范圍不斷擴大，其危害也越來越大。特別是近年來犬瘟熱在非人靈長類動物中的暴發,引發了人們對其可能感染人類的潛在危害的思考。首次報道非人靈長類動物感染犬瘟熱病毒是Yoshikawa等[3]曾對從野外捕獲的22只日本獼猴進行了長達1年半的隔離。試驗結果表明，這次日本獼猴發生的是CDV感染，而不是MV及其他麻疹病毒屬病毒感染，傳染源可能來自獸醫院就診的犬[4-5]。2008年前后，中國和日本的恒河猴先后暴發犬瘟熱[1-2,6]，使犬瘟熱病毒的跨種傳播研究成為了研究的熱點[7]。

犬瘟熱病毒基因組編碼6個蛋白[8]，N蛋白是核衣殼主要成分，保守性較強，野毒株與疫苗株Onderstepoort的N蛋白及其基因的同源性分別為95.2%和93.2%，氨基酸序列差別最大的區域是N端和C端，CDV強毒株N末端可變區氨基酸的改變影響不大，C末端結構的變化能導致M蛋白對核衣殼的吸附作用的改變，強弱毒株C末端的不同能夠導致病毒的裝配、囊膜的形成和病毒在細胞表面釋放的不同[9-10]。F蛋白介導囊膜和細胞膜融合，是感染性病毒粒子進入宿主細胞所必需的，CDV野毒株與疫苗株F蛋白及基因的同源性分別為95.7%和90.1%，F蛋白的13個半胱氨酸殘基和4個潛在的N-聯糖基化位點完全保守,F蛋白存在高度的表位同源性[11-12]。因此我們選擇這兩個基因作為研究對象，研究結果進一步說明恒河猴發病的病原體為CDV或其新的變異株，該毒株與黑龍江分離株狐貍毒株(CDV-FOX-HLJNM)遺傳關系較近，由此可推測恒河猴飼養場中犬瘟熱的傳染源可能是由附近的犬或犬科動物傳入的野毒株，而非疫苗株。本研究為恒河猴飼養場對暴發類麻疹綜合征的恒河猴的治療提供了一定的參考依據，同時也提示恒河猴的飼養和繁殖單位應加強對犬瘟熱的防控，以減少恒河猴的類似感染及死亡所造成的經濟損失。

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QIU Wei， WANG Wen-bo， HU Ting-song， YU Jing， GUO Ping， ZHENG Ying，

ZHANG Fu-qiang, FAN Quan-shui

(Center for Disease Control and Prevention of Chengdu Military Region ， Kunming 650118 ， China)

The full-length N and F genes of CDV in rhesus monkey were cloned and sequenced.The full length of N gene and F gene was 1572 bp and 2080 bp,respectively.The results indicated that the homology of the nucleotides(and amino acids) of the N gene with CDV vaccine Onderstepoort vaccine x and standard wild strain A75-17 were 93.6%(96.9%)，97.3%(99.0%) and 97.3%(99.0%)，respectively.The homology of the nucleotides(and amino acids) of the F gene with CDV vaccine Ondersteport and vaccine x and standard wild strain A75-17 were 91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)and 94.4%(97.9%),respectively.The phylogenic analysis showed that the CDV of rhesus monkey had close relationship with Fox strain of Heilongjiang(CDV-FOX-HLJNM).The result proved that the CDV in rhesus monkey was a wild strain,but not a vaccine strain.

Rhesus monkey ； Canine distemper virus ； Nucleocapsid protein gene ； Fusion protein gene ； Sequence analysis

FAN Quan-shui

2016-03-16

公益性行業(農業)科研專項(201303042)

邱薇(1971-)，女，研究員，博士，主要從事動物病毒學、分子生物學研究，E-mail:qiuwei1971@126.com

范泉水，E-mail:fqs168@126.com

S854.4+3

A

0529-6005(2017)02-0026-03