蛋氨酸對水貂毛乳頭細胞生長的影響

南韋肖 ， 張海華 ， 司華哲 ， 李光玉 ， 婁玉杰

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟動物分子生物學重點實驗室，吉林長春1301121； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院, 吉林長春1301181)

蛋氨酸對水貂毛乳頭細胞生長的影響

南韋肖1,2， 張海華1， 司華哲1,2， 李光玉1， 婁玉杰2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟動物分子生物學重點實驗室，吉林長春1301121； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院, 吉林長春1301181)

為了研究在培養(yǎng)基中添加不同濃度蛋氨酸對水貂毛乳頭細胞增殖、周期的影響。使用兩步酶法分離培養(yǎng)毛乳頭細胞，經(jīng)鑒定后，在對照組常規(guī)培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的蛋氨酸，通過MTT法計算毛乳頭細胞的增殖率、流式細胞術(shù)檢測蛋氨酸對細胞周期的影響。結(jié)果培養(yǎng)基中添加蛋氨酸可以促進細胞增殖，其中添加8 μg/mL蛋氨酸組的增殖率最高；當濃度64 μg/mL時，對毛乳頭細胞的增殖有抑制作用。添加8 μg/mL蛋氨酸組處于G1期的細胞比率小于對照組，細胞增殖指數(shù)、S期和G2期比率明顯高于其他兩組。表明在本試驗條件下，在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的蛋氨酸可以促進水貂毛乳頭細胞的增殖，提高細胞的增殖活力。

蛋氨酸 ； 水貂 ； 毛乳頭細胞 ； 細胞增殖

毛乳頭可以誘導(dǎo)和維持毛囊的周期性循環(huán)，具有確定和維持毛母質(zhì)細胞增殖分化的作用，而毛球部毛母質(zhì)細胞的增殖分化是毛囊周期性生長調(diào)控的關(guān)鍵[1]。毛乳頭細胞在毛囊的形態(tài)學發(fā)生及其周期性生長調(diào)控中處于中心環(huán)節(jié)，其顯著的生物學特性是在體內(nèi)外表現(xiàn)為凝集性的生長方式及體內(nèi)外具有誘導(dǎo)毛囊形成的能力[2]，既提供毛囊生長和分化必需的信號因子和營養(yǎng)支持，也決定毛囊的分化方向[3]。毛乳頭的功能障礙是導(dǎo)致毛囊周期失衡和休止期脫發(fā)的主要起始因素[4]。最近許多研究人員進行了利用體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞誘導(dǎo)體內(nèi)毛囊生長的試驗，他們將人毛乳頭種植到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)裸鼠長出毛發(fā)[3]，證實了毛乳頭具有誘導(dǎo)毛發(fā)再生的功能。因此對毛乳頭細胞的功能狀態(tài)的研究已逐漸成為毛囊生長、發(fā)育及周期調(diào)控的熱點。

蛋氨酸可以提高生物合成角蛋白的強度，加速毛的生長，提高凈毛率和改善毛的品質(zhì)[5-6]。Rasmussen P V[7]等研究發(fā)現(xiàn)，低蛋白質(zhì)日糧可導(dǎo)致冬毛期水貂推遲毛皮成熟時間，阻礙毛囊再生，影響水貂毛皮的絨毛密度。Zhang[8]等發(fā)現(xiàn)，在水貂的低蛋白質(zhì)日糧和添加蛋氨酸有促進毛囊進入生物周期下一階段的趨勢。易先國[5]等在妊娠兔飼糧中添加蛋氨酸，對胎兒皮膚毛囊的毛球和毛乳頭的生長有一定的促進作用。目前，以人、鼠、羊的毛乳頭為模型的研究均有報道[9]，且研究比較深入，以水貂毛乳頭細胞為模型的研究未見報道。本試驗擬通過建立水貂毛乳頭細胞的培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)液中添加不同濃度的蛋氨酸，觀察蛋氨酸對水貂毛乳頭細胞的增殖、周期的影響，明確蛋氨酸對水貂毛乳頭細胞的影響途徑，為探討水貂毛乳頭細胞發(fā)育調(diào)控機制，并尋求從分子水平提高水貂毛皮品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物：5只5月齡健康美國標準黑雄性水貂，由中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所毛皮動物基地提供。

1.2 方法

1.2.1 毛乳頭的分離 將水貂麻醉后，通過手術(shù)采集1 cm2水貂背部皮膚樣品，剪去裸露毛干和皮下脂肪，用無菌PBS(pH值=7.4，含青霉素100 IU/L、鏈霉素100 μg/mL)沖洗干凈，碘酒擦拭后用75%酒精脫碘，之后將皮膚樣品浸入PBS中帶入超凈臺工作。超凈臺中棄PBS，放入75%乙醇15 s后，將皮膚放入于PBS中沖洗2遍，再剪成長條并置于分離酶中4 ℃消化過夜，第2天37 ℃復(fù)溫30 min，之后用眼科剪將皮膚剪成碎泥狀放入膠原酶D中消化6 h左右，在鏡下觀察到脂肪呈液態(tài)、大量的毛乳頭細胞游離出來，用含血清的DMEM終止消化。鏡下?lián)鞙y，放入24孔板中進行培養(yǎng)。

1.2.2 毛乳頭細胞的鑒定 將培養(yǎng)的第3代毛乳頭細胞接種于蓋玻片上，用PBS清洗細胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，每次5 min。1%Triton X-100通透30 min，PBS清洗3次，每次5 min，5%BSA封閉30 min，移除多余的BSA，覆蓋鼠α-平滑肌肌動蛋白抗體(α-SMA)，陰性對照由等量的PBS代替，4 ℃過夜，次日37 ℃復(fù)溫30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，加入熒光標記的山羊抗鼠IgG，室溫避光 60 min，DAPI封片，完成后，用熒光顯微鏡拍攝照片。1.2.3 毛乳頭細胞增殖的測定 將第4代DPC濃度調(diào)整在1×104接種至96孔板，每孔100 μL細胞懸液，待細胞貼壁吸去培養(yǎng)基，加入蛋氨酸濃度為0、2、4、8、16、32及64 μg/mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每個濃度6個復(fù)孔。空白對照組只加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，不含細胞。蛋氨酸作用48 h后，加入5 g/L的MTT，每孔20 μL，繼續(xù)在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，4 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后采用ELISA酶標儀在490 nm波長條件下讀取每組吸光度值，根據(jù)吸光度值計算細胞增殖率。增殖率=(試驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(陰性吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.2.4 毛乳頭細胞周期的測定 將第4代毛乳頭細胞培養(yǎng)在10 cm培養(yǎng)皿中，加入蛋氨酸濃度分別為0、8、64 μg/mL，待毛乳頭細胞達到1×105后，用0.25%胰蛋白酶消化各組細胞，PBS洗滌2次，離心收集細胞，70%冷乙醇4 ℃固定過夜。PBS洗滌細胞2次，1 000 r/min離心5 min。各管分別加入500 μL PBS，加入濃度為50 μg/mL的RNase A 37 ℃水浴30 min，之后加入PI使之濃度為50 μg/mL，室溫避光30 min，300目濾網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測細胞周期，計算細胞增殖指數(shù)(Proliferation index,PI)，PI=[S+(G2/M)]/[(G0/G1)+S+(G2/M)]×100%。1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 17.0進行單因素ANOVA方差分析，P<0.05為差異顯著，采用“平均數(shù)±標準差”表示試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 毛乳頭細胞的分離培養(yǎng) 水貂毛乳頭細胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d左右便開始貼壁，周圍開始有細胞長出，在高倍鏡下可見剛長出的細胞呈多角形(見中插彩版圖1)。隨著天數(shù)的增加，在低倍鏡下可以觀察到細胞呈凝集性生長(見中插彩版圖2)，凝集團周圍的細胞排列呈放射狀，細胞增殖速度快。凝集成團的毛乳頭細胞可以形成類似最初分離出的毛乳頭細胞(見中插彩版圖3)，傳代后增殖速度也較快，但隨著細胞代數(shù)的增加，凝集性生長現(xiàn)象逐漸消失。

2.2 毛乳頭細胞的鑒定 本試驗采用免疫熒光及免疫組化的方法檢測了毛乳頭細胞特異性標記蛋白α-SMA在水貂毛乳頭細胞中的表達。如中插彩版圖圖4所示，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，毛乳頭細胞表達α-SMA，呈陽性，符合DPC特性。在熒光顯微鏡下觀察純化后細胞，可見藍光激發(fā)細胞發(fā)出的綠色熒光(見中插彩版圖4)。

2.3 蛋氨酸濃度對水貂毛乳頭細胞增殖的影響 處于對數(shù)生長期的第4代毛乳頭細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的蛋氨酸培養(yǎng)48 h后，在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在蛋氨酸濃度大于32 μg/mL時，部分細胞漂浮，其余并未發(fā)現(xiàn)明顯變化。MTT結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中添加2、4、8 μg/mL的蛋氨酸增殖率顯著高于對照組(P<0.05)，其中加入8 μg/mL蛋氨酸組毛乳頭細胞增殖率最高，64 μg/mL組的細胞增殖率與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，且增殖率為98.78%，低于對照組。

表1 蛋氨酸對水貂毛乳頭細胞增殖的影響

同列比較用a，b，c表示，數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.4 蛋氨酸濃度對水貂毛乳頭細胞周期的影響 體外培養(yǎng)的水貂毛乳頭細胞加入不同濃度的蛋氨酸，作用48 h后，流式細胞儀檢測細胞周期的結(jié)果如下(見中插彩版圖5)，添加8 μg/mL蛋氨酸組與正常對照組相比細胞周期有明顯差異，處于G1期的細胞比率小于對照組，細胞增殖指數(shù)、S期和G2期比率明顯高于其他兩組，添加64 μg/mL蛋氨酸組的細胞周期與對照組比較有明顯差異，處于G1期的細胞比率大于對照組，細胞增殖指數(shù)、S期和G2期比率小于對照組。

表2 蛋氨酸濃度對體外培養(yǎng)的水貂毛乳頭細胞周期的影響

3 討論

蛋氨酸在代謝過程中可以形成聚胺，促進細胞分裂及蛋白質(zhì)的合成。周勤飛[10]等研究表明，當飼糧中蛋氨酸含量為0.64%時，肉兔生長性能和毛皮品質(zhì)最優(yōu)。陶可[6]研究發(fā)現(xiàn)，提高妊娠母兔飼糧中蛋氨酸水平，可以促進初生胎兒和2月齡幼兔的皮膚的頭部和臀部中的次級毛囊密度，從而增加總毛囊密度，對以后的產(chǎn)毛性能產(chǎn)生了影響。多胺包括腐胺、精脒和精胺，廣泛存在于生物體的各種組織細胞內(nèi)，是一種重要的代謝調(diào)控物質(zhì)，在細胞增殖分化中起重要作用，多胺的前體包括L-蛋氨酸，L-蛋氨酸可以通過L-蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶催化生成S-腺苷蛋氨酸，再經(jīng)S-腺苷蛋氨酸脫羧酶生成脫羧的S-腺苷蛋氨酸，為精脒和精胺的合成提供氨丙基[11]。在細胞體外培養(yǎng)的試驗中，若細胞培養(yǎng)液或細胞中含高濃度的多胺，會有細胞毒作用的發(fā)生[12]。本試驗中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加2～32 μg/mL的蛋氨酸對體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞均有促增殖作用，其中增殖率最高的是8 μg/mL，這可能是因為蛋氨酸在代謝過程中可以生成聚胺，促進了細胞的分裂和蛋白質(zhì)的合成，并且蛋氨酸的添加可能會誘導(dǎo)多胺的生成，從而提高了細胞的增殖率。而在培養(yǎng)基中添加64 μg/mL的蛋氨酸對體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞相比對照組存在抑制作用，這可能是因為蛋氨酸的毒性可能與其代謝中間產(chǎn)物以及蛋氨酸影響氨基酸代謝中某些酶活性有關(guān)[13]，引起組織細胞中氨基酸失衡，導(dǎo)致相關(guān)蛋白質(zhì)合成代謝障礙，并且蛋氨酸過多的添加有可能使培養(yǎng)液或細胞中多胺的含量增加，發(fā)生了細胞毒作用。

從細胞周期的代謝過程看，細胞周期包括Gl期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有絲分裂期)[14]。研究表明，若細胞缺少多胺，會使細胞周期停滯于G1期，細胞凋亡過程中多胺的含量也是下降的[15]。本試驗中添加8 μg/mL蛋氨酸組PI值最高，其可能作用機制是在培養(yǎng)基中添加蛋氨酸可以生成更多的類似多胺的物質(zhì)，從而可以促使處于靜止態(tài)的Gl期細胞向S期轉(zhuǎn)變，使DNA合成量增加，從而促進細胞的增殖。而添加64 μg/mL的蛋氨酸對體外培養(yǎng)的水貂毛乳頭細胞產(chǎn)生了細胞毒作用，從而其處于G1期的細胞比率大于正常組，細胞增殖指數(shù)、S期和G2期比率均小于對照組。一定濃度的蛋氨酸可以促進體外培養(yǎng)的水貂毛乳頭細胞增殖的具體作用機制還有待繼續(xù)研究。

4 結(jié)論

在培養(yǎng)基中添加一定濃度的蛋氨酸可以促進水貂毛乳頭細胞的增殖，其中效果最好的是8 μg/mL，添加64 μg/mL的蛋氨酸對體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞的生長有抑制作用。添加適宜量的蛋氨酸可以提高細胞的增殖指數(shù)，促使體外培養(yǎng)的水貂毛乳頭細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變。

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Effects of Methionine on the Developmental of Mink Dermal Papilla Cellsin vitro

NAN Wei-xiao1,2, ZHANG Hai-hua1, SI Hua-zhe1,2, LI Guang-yu1, LOU Yu-jie2

(1.Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences,State Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals, Changchun 130112, China;2.Animal Science and Technology College，Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

We studied the effect of different methionine level on proliferation and cycle of mink dermal papilla cells(DPCs).DPCs were isolated and cultivated with two step method.After cells were identified,the fourth passage cells were cultured in medium supplemented with methionine.The cell proliferation was analyzed by MTT,and flow cytometry was used to evaluate the effect of Met on DPC cycles. Our results showed that methionine enhanced DPC proliferation,especially the addition of 8μg/mL of methionine.However,it suppressed the proliferation of DPC at the concentration of 64μg/mL.Cells in G1 phase in the group with 8μg/mL methionine were less than that in the control group.However，and cell proliferation index,and cells in S and G2 phases were significantly higher than the other two groups.Adding appropriate concentration of methionine in the culture medium can promote DPC proliferation and enhance cell proliferation activity.

Methionine ; Mink ; Dermal papilla cells ; Cell proliferation

s：LI Guang-yu ; LOU Yu-jie

2016-04-06

國家自然科學基金(31301956)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140520178JH)

南韋肖(1990-)，女，碩士，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學，E-mail:339555262@qq.com

張海華(1983-)，女，副研究員，博士，研究方向為特種經(jīng)濟動物營養(yǎng)與分子營養(yǎng)，E-mail：zhh83@126.com

李光玉，E-mail:tcslgy@126.com；婁玉杰，E-mail:lyjjlau@163.com

S865.22

A

0529-6005(2017)02-0023-03

注：張海華與南韋肖對本文具有同等貢獻