8株鴿源新城疫病毒廣西分離株HN基因的遺傳進化分析

盧冰霞 ， 梁家幸 ， 段群棚 ， 陳忠偉 ， 蔣冬福 ， 盧敬專 ， 周英寧 ，閉炳芬 ， 何 穎 ， 秦毅斌 ， 李 斌 ， 蘇乾蓮 ， 趙 武

(廣西獸醫研究所廣西獸醫生物技術重點實驗室， 廣西南寧530001)

8株鴿源新城疫病毒廣西分離株HN基因的遺傳進化分析

盧冰霞 ， 梁家幸 ， 段群棚 ， 陳忠偉 ， 蔣冬福 ， 盧敬專 ， 周英寧 ，閉炳芬 ， 何 穎 ， 秦毅斌 ， 李 斌 ， 蘇乾蓮 ， 趙 武

(廣西獸醫研究所廣西獸醫生物技術重點實驗室， 廣西南寧530001)

應用RT-PCR方法對分離自廣西不同鴿場的8株鴿源NDV廣西分離株HN基因進行擴增、序列測定和分析，旨在探討廣西鴿源NDVHN基因的分子進化特點，為科學防控鴿源新城疫提供依據。結果顯示，8株鴿源NDV廣西分離株HN基因的ORF全長均為1 716 bp，編碼571個氨基酸，屬于強毒的C群，符合強毒株的基因長度特征。核苷酸同源性比較顯示，8株鴿源NDV分離株與NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亞型同源性最高，為90.4%～99.5%。遺傳進化分析顯示，8株鴿源NDV廣西分離毒株與我國2011-2013年廣西、廣東、吉林、遼寧、云南、黑龍江等地鴿源NDV分離株的遺傳關系較為接近，位于同一進化樹分支上，初步推測8株鴿源NDV廣西分離株應屬于classⅡ基因Ⅵb亞型NDV。

鴿； 新城疫病毒；HN基因； 遺傳進化

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種能使多種禽類感染的急性、高度接觸性、致死性傳染病，給世界養禽業造成巨大的經濟損失。NDV是副黏病毒科、副黏病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬的成員，為有囊膜、單股負鏈RNA病毒，基因組全長約為15 kb，由3′到5′端依次編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經氨酸酶(HN)和大蛋白(L)這6種病毒蛋白。鴿源新城疫病毒(PigeonNewcastleDiseasevirus，PNDV)，也稱為鴿源禽Ⅰ型副黏病毒(PigeonParamyxovirusTypeⅠ，PPMV-1)為NDV成員之一[1]。已被公認，HN蛋白對細胞融合作用是必須的[2]。HN蛋白兼具以下幾種生物功能：即在NDV侵染過程中識別靶細胞的唾液酸受體；介導病毒吸附細胞膜，促進新病毒粒子的釋放；促進融合功能；病毒毒力和抗原性的決定等[3]。最近研究發現，F蛋白并不是導致NDV毒力強弱的惟一因子，單獨HN蛋白也可發揮作用[4]?？贵w免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異,且其受影響程度高于F基因[5]，因此HN基因的變異更能代表NDV的進化規律和趨勢。本試驗應用RT-PCR方法對廣西地區2011-2014年間獲得的8株鴿源NDV分離株的HN基因進行擴增及序列測定，應用軟件將其與國內外不同NDV毒株進行序列分析比較，并構建系統進化樹，旨在研究鴿源NDV廣西分離株的遺傳變異趨勢，為廣西鴿ND疫情的監測和防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 毒株 鴿源NDV廣西分離株GX1、GX2、GX3、GX4、GX6、GX7、GX13和GX16均由本實驗室分離鑒定和保存。1.2 試劑 RNA抽提試劑盒為AXYGEN公司產品；反轉錄酶(M-MLV)、RNA酶抑制劑為Invitrogen公司產品；DNA Marker DL-2 000為TaKaRa公司產品；ExTaq為寶生物工程(大連)有限公司產品，其他試劑均為分析純。1.3 引物設計與合成 NDVHN基因擴增引物為參考孫敏華[6]等(2010)所設計的引物，由Invitrogen公司合成。擴增片段大小為2 265 bp。

1.4 8株鴿源NDV廣西分離株的增殖和病毒總RNA的制備 將8株鴿源NDV分別接種9日齡SPF雞胚，37 ℃孵育24 h～96 h后收取尿囊液。尿囊液反復凍融3次，6 000r/min離心10 min后取上清，按AXYGEN公司的AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒操作說明書提取病毒總RNA，-20℃保存備用。

1.5HN基因RT-PCR擴增及測序 提取的RNA反轉錄反應體系和反應條件：RNA模版14.5 μL，5×RT Buffer 5 μL，DTT 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1 μL，隨機引物(Random 6mers)(25 μmol/L) 1 μL，RNase Inhibitor(10 U/μL) 0.5 μL，M-MLV 0.5 μL，37 ℃孵育60 min。

HN基因擴增PCR反應體系和反應條件：RT產物 2.5 μL，10×ExtaqBuffer 2.5 μL，F1(25 μmol/L)、F2(25 μmol/L)各1.0 μL，dNTP 1 μL，ExTaq0.125 μL ddH2O 17 μL。反應條件為：94 ℃、5 min，94 ℃、45 s，50 ℃、1 min，72 ℃、2.5 min，36個循環；最后72℃延伸10 min。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，將特異性擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。1.6 序列分析和進化樹分析 應用DNAStar和MEGA5.05軟件，將測序獲得的8株鴿源NDVHN基因序列與GenBank 上已公布的國內外NDV 代表毒株的HN基因序列進行比對分析，并繪制系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 鴿源NDVHN基因的PCR擴增和序列測定結果 運用RT-PCR對8株分離株進行HN基因的擴增，均擴增出與預期大小相一致的目的片段，約2 265 bp，電泳結果見圖1。8株鴿源NDV廣西分離株HN基因的ORF全長均為1 716 bp，編碼571個氨基酸。

圖1 分離株HN基因擴增結果

1：Marker DL-2 000； 2～9：GX1、GX2、GX3、GX4、GX6、GX7、GX13、GX16

2.2 鴿源NDVHN基因序列的比較分析及系統進化樹 運用DNAStar軟件將測序正確的8株鴿源NDVHN基因序列與GenBank上已發表的國內外NDVHN基因代表株參考序列進行比較分析。結果顯示，獲得的8株鴿源NDV廣西流行毒株HN基因之間的核苷酸序列同源性為93.5%～99.9%(其中GX3與GX7的核苷酸序列同源性為93.5%，GX4和GX7的核苷酸同源性為99.9%)，所推導的氨基酸序列同源性為94.8%～99.7%(其中GX1與GX7的同源性最低，為94.8%；GX4和GX7的氨基酸序列同源性最高為99.7%)。與國內外NDVclassⅡ參考毒株的核苷酸同源性為80.2%～99.5%，氨基酸同源性為86.2%～99.8%；其中與NDV基因Ⅵ型的同源性較高，為90.4%～99.5%；與其他基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型毒株的同源性在81.3%～89.2%之間。與NDVclassⅠ參考毒株、強毒株F48E9、Ⅰ型疫苗株V4、I-2、Ⅱ型疫苗株LaSota和B1的核苷酸同源性分別為66.9%～68.3%，82.7%～84.6%、82.2%～83.9%和81.9%～83.2%、80.2%～82.0%和80.5%～82.0%；氨基酸同源性分別為81.3%～83.0%、88.5%～89.2%、88.5%～89.9%和86.7%～87.9%、86.9%～88.1%和86.9%～87.9%。

運用MEGA5.05軟件繪制HN基因系統發育樹，結果表明8株鴿源NDV廣西分離毒株同處于一個大的進化樹分支上，與classⅡ基因Ⅵb亞型毒株如2011年比利時分離株11等在同一大分支上，但相互之間又分屬于不同的小進化樹分支上。8株鴿源NDV廣西分離毒株與我國2011-2013年廣西、廣東、吉林、遼寧、云南、黑龍江等地鴿源NDV分離株的遺傳關系較為接近。而與我國經典強毒株NDV F48E9、Ⅰ型疫苗株V4和I-2、Ⅱ型疫苗株LaSota和B1的遺傳距離較遠(見圖2)。

3 討論

HN基因中有一個長的開放閱讀框，由于終止密碼位置的差異,其翻譯的多肽鏈長短不同,據此NDV可分為3個群：A群，ORF全長為1 851 bp，編碼616個氨基酸，為非活性多肽前體(HN0)，需要經過水解才能轉化成為有生物活性的HN蛋白，該蛋白只存在與無致病性的NDV弱毒株中；B群，ORF全長為1 734 bp，編碼577個氨基酸，為具有生物活性的蛋白，存在于無致病性和致病性的NDV毒株中；C群，ORF全長為1 716 bp，編碼571個氨基酸，該蛋白也具有生物活性，但僅存在于致病性的NDV強毒株中[7]。本研究成功擴增出8株鴿源NDV廣西分離毒株HN基因的核苷酸序列，并展開對HN基因的測序分析研究。經測定8株鴿源NDV廣西分離毒株的HN基因ORF均為 1 716 bp，編碼 571 個氨基酸，屬于強毒的 C 群，符合NDV強毒株的基因長度特征，與用NDV F0裂解位點來判斷其為強弱毒株的結果一致[8]。

8株鴿源NDV廣西分離毒株HN基因與國內外NDV標準毒株及弱毒株的HN基因比較，核苷酸和氨基酸同源性分別在80.2%～84.6%和 86.7%～89.9%之間，結果表明，8株鴿源NDV廣西分離毒株均已發生一定的變異。從系統進化樹上可以看出，本次分離鑒定的毒株與我國2011-2013年廣西、廣東、吉林、遼寧、云南、黑龍江等地鴿源NDV分離株的遺傳關系較為接近，屬于同一個基因群，表明近年來我國鴿群中流行的鴿源NDV毒株較相近，分離自我國不同地區的鴿源NDV毒株并沒有明顯的地域差異性。根據對HN基因的遺傳進化分析結果，初步推測8株鴿源NDV廣西分離毒株應屬于classⅡ基因Ⅵb亞型NDV。對于8株鴿源NDV廣西分離毒株與其他地區鴿源NDV分離株的深層次相關性有待進一步研究。

圖2 8株鴿源NDV廣西分離株與國內外41個NDV毒株HN基因系統進化樹▲：分離； ◆：疫苗株； ●：強毒株F48E9

目前我國ND的流行與世界上的流行趨勢相一致，即同一地區存在不同的基因型，危害家禽的以基因Ⅶ型為主，而危害鴿子的以基因Ⅵ型為主，并且不同基因型在不同地區循環發生，目前鴿群免疫用疫苗株主要為NDV基因Ⅰ型疫苗株V4和基因Ⅱ型疫苗株LaSota，與流行毒株基因型及抗原性均有較大差異，免疫后不一定能夠提供100%的完全保護，導致免疫失敗，鴿ND發病率仍居高不下[9]。因此，迫切需要研制出含有基因Ⅵ型的鴿源NDV毒株的有效的鴿群專用的優質疫苗。本文對 8株鴿源NDV廣西分離株HN基因的克隆和序列的測定，為掌握鴿源NDV廣西流行毒株病原學特性、分子流行病學和毒株的遺傳變異情況提供了初步材料，對于有效防控鴿ND的發生或者降低其對雞ND的發生和流行的危害均具有參考借鑒意義。

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[2] 白艷波，張七斤.雞新城疫病毒內蒙古毒株HN蛋白基因的序列分析與同源性比較[J].獸醫科技，2010，46(5)：110-112.

[3] Ring C J.Cytolytic virus as potential anti-cancer agents[J].J Gen Virol，2002，83(3)：491-492.

[4] Huang Z，Panda A，Elankumaran S，etal.The hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus determines tropism and virulence[J].J Virol，2004，78：4176-4184.

[5] 鞏艷艷，崔治中.細胞培養上新城疫病毒HN基因在抗體免疫選擇壓作用下的抗原表位變異[J].中國科學，2009，39：1175-1180.[6] 孫敏華，呂殿紅，董嘉文，等.一株鴿源新城疫病毒主要毒力基因分析[J].廣西畜牧獸醫科技，2010，35(5)：30-34.

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[9] 何琴，焦培榮，劉大偉，等.一株廣東鴿新城疫病毒的生物學特性分析[J]．動物醫學進展，2011，32(9)：23-26.

Genetic evolution analysis ofHNgene segments of eight pigeon NDVstrains isolated in Guangxi

LU Bing-xia, LIANG Jia-xing, DUAN Qun-peng, CHEN Zhong-wei, JIANG Dong-fu, LU Jing-zhuan,ZHOU Ying-ning, BI Bing-fen, HE Ying, QIN Yi-bin, LI Bin, SU Qian-lian, ZHAO Wu

(Guangxi Veterinary Research InstituteGuangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Nanning 530001, China)

TheHNgene of eight NDV strains isolated from Guangxi different pigeon farms,were amplified by RT-PCR method,sequenced and analyzed. The aim of this study is to explore the molecular evolution characteristics of Guangxi pigeon NDVHNgene,and to provide the basis for scientific prevention and control of Pigeon Newcastle disease. The results showed that the nucleotide sequence length ofHNgene of the eight NDV isolates was 1716 bp,encoding 571 amino acids. They belonged to the virulent C group,and the gene length characteristic ofHNgene of the eight NDV isolates was in accord with the virulent strain.The analysis of nucleotide homologies indicated that the eight NDV isolates shared higher homology with genotype Ⅵb,ranging from 90.4% to 99.5%.The phylogenetic tree analysis demonstrated that the genetic relationship between the eight guangxi NDV strains and the isolates from Guangxi,Guangdong,Jilin,Liaoning,Yunnan,and Heilongjiang from 2011 to 2013 was close. They were located in the same cladogram branch. We assume that the eight pigeon NDV isolates isolated in Guangxi all belong to the gene class Ⅱ genotype Ⅵb NDV.

pigeon ; Newcastle disease virus ;HNgene ; Phylogenetic analysi

ZHAO Wu

2016-10-19

廣西獸醫生物技術重點實驗室系統性研究課題(14-045-31-A-5)；廣西獸醫研究所基本科研業務費專項(桂科專項2016-2)

盧冰霞(1986- )，女，助理研究員，碩士，主要從事動物病毒學研究，E-mail：lubingxia13@163.com

，趙武，E-mail：zhaowu168866@163.com

S855.3

A

0529-6005(2017)02-0019-04