乳鼠肌源干細胞的培養及其成肌分化的實驗研究

任振敏　馬東禮　黃錦桃　李朝紅　謝富康

肌源干細胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)存在于肌纖維的肌膜與基板之間，多處于靜息期，在肌肉組織損傷并需要修復時大量增殖，它維持著肌肉組織的自我更新[1]。經研究發現，MDSCs在一定條件下可分化為骨骼肌細胞、平滑肌細胞[2]、甚至神經細胞[3]。MDSCs作為種子細胞，已用于壓力性尿失禁[4]、杜氏肌營養不良[5]、心肌疾病[6]等較多疾病的治療研究。本研究的目的就是體外培養MDSCs并初步探討其成肌特性，為以后的基因治療和組織工程奠定基礎。

對象與方法

1.對象：新生3～5 d的SD乳鼠(中山大學動物實驗中心提供)，DMEM/F12培養基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(天津TBD公司)，Dispase酶(Roche公司)，Cardiac troponin T抗體(Santa Cruz公司)，胰蛋白酶、明膠、膠原酶I、DAPI、乙酰膽堿、α-銀環蛇毒素試劑購于Sigma公司，PBS平衡液、結蛋白(desmin)單克隆抗體、骨骼肌肌球蛋白(skeletal myosin)抗體購于博士德公司。

生長培養基(DMEM/F12+20%FBS)、分化培養基(DMEM/F12+5%FBS)。

2.MDSCs的分離、純化和培養：新生3～5 d的SD乳鼠，于無菌條件下取后肢骨骼肌，放在0.1 mol PBS液中，解剖顯微鏡下剔除筋膜、肌腱、血管和脂肪組織。將肌組織塊用PBS沖洗3遍，用解剖剪將組織塊剪成1 mm3大小，移入離心管中，再用PBS反復吹打3次，靜置1 min后，棄去上層液體和漂浮組織。按每克肌肉2 ml混合消化酶(Dispase 2.4 U/ml，0.2% collagenase，2.5 mmol/L CaCl2)進行消化，37 ℃，1 h，加5倍體積的DFl2+20% FBS終止消化，反復吹打后經200目的不銹鋼濾網過濾，離心，重懸。

反復差速貼壁法(preplate)純化MDSCs：將細胞懸液吸入經明膠包被的培養瓶中培養2 h，貼壁的細胞為PPl(preplate1)；未貼壁的細胞懸液轉入另一培養瓶中培養24 h，貼壁的細胞為PP2 (preplate2)；未貼壁的細胞懸液再轉入另一培養瓶中培養24 h，貼壁的細胞為PP3(preplate3)；未貼壁的細胞懸液轉入另一培養瓶中培養24 h，貼壁的細胞為PP4(preplate4)，供進一步細胞鑒定和分化實驗用。

原代培養第1天首次換液，以后每3天換液一次。當細胞達70%～80%融合，換用分化培養基繼續培養，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況及肌管自發性收縮現象。

3.MDSCs的鑒定：將生長狀態較好的細胞經消化后種于爬片上，第2天取出爬片；PBS小心沖洗3遍；1%Triton X-100/4%PFA固定、破膜30 min；PBS沖洗3遍；正常山羊血清(1∶10)封閉30 min；加一抗desmin(小鼠抗人，1∶100)，4 ℃過夜；PBS沖洗3遍：加TR標記的二抗(山羊抗小鼠，1∶100)，室溫避光保濕孵育1 h；PBS沖洗3遍；DAPI復染核15 min；PBS洗3遍，過雙蒸水1遍：適量緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

4.肌管的Skeletal myosin、cardiac troponin T免疫熒光鑒定：六孔板中生長狀態較好的肌管，吸干廢液；PBS小心沖洗3遍；1%Triton X-100/4%PFA固定、破膜30 min；PBS沖洗3遍；正常山羊血清(1∶10)封閉30 min；加一抗skeletal myosin(小鼠抗兔，1∶100)或cardiac troponin T(小鼠抗大鼠，1∶200)，4 ℃過夜；PBS沖洗3遍；加TR標記的二抗(山羊抗小鼠，1∶100)，室溫避光保濕孵育1 h；PBS沖洗3遍；DAPI復染核15 min；PBS沖洗3遍，過雙蒸水一遍；適量緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

5.肌管乙酰膽堿受體的鑒定：α-銀環蛇毒素試劑已與熒光染料羅丹明結合,可在熒光顯微鏡下發紅光。原試劑濃度為100 μmol/L，用分化培養基配制成終濃度為10 nmol/L供實驗用。乙酰膽堿為粉末狀，用分化培養基配制成終濃度為10 nmol/L供實驗用。將培養4 d的肌管吸去培養基，分化培養基洗3遍,實驗組加入配好的銀環蛇毒素，37℃孵育60 min；對照組加入配好的乙酰膽堿30 min，分化培養基洗3遍后，再加入配好的銀環蛇毒素，37℃孵育60 min；實驗組和對照組吸去銀環蛇毒素，PBS洗3遍；4%PFA固定20 min；PBS洗3遍；超純水洗1遍；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

6.統計學處理：用SPSS 16.0進行統計分析，PP2、PP3、PP4得到的單位視野MDSCs陽性率的兩兩比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1.MDSCs的純化和培養：倒置相差顯微鏡下觀察，混合酶消化后，剛接種的細胞呈圓形，折光性強。PP1、PP2細胞貼壁迅速，細胞數量多，生長迅速，PP3、PP4細胞數量逐漸減少，細胞折光性強，貼壁緩慢，PP4用生長培養基培養1天，細胞形態逐漸變成梭形，隔3天換液一次，待細胞生長至70%～80%后傳代。培養第二代的細胞增殖到70%～80%時，加入分化培養基，培養第4天，形成粗大的肌管，可見多個細胞核排列在肌管的中央，培養第6天，逐漸沿一個方向平行排列，部分肌管相互交織形成網狀結構(圖1)。

A.培養1天的PP1；B.培養1天的PP2；C.培養1天的PP3；D.培養1天的PP4；E.PP2培養6天分化成的肌管；F.PP3培養6天分化成的肌管；G.PP4培養6天分化成的肌管 圖1　混合酶消化法和preplate分離純化的MDSCs及分化成的肌管(bar=100um)

2.MDSCs的鑒定：Desmin是肌肉特異性的中間絲蛋白，是最早表達于活化的肌源性干細胞的蛋白之一，存在于骨骼肌、心肌及平滑肌細胞的胞漿中，在維持肌細胞的形態和功能方面起著重要的作用，也是國內外研究者鑒定MDSCs最常用的指標[7-8]。圖2A顯示經Desmin免疫熒光檢測，MDSCs呈陽性反應為紅色，DAPI染細胞核呈藍色，20倍物鏡下隨機數20個視野的細胞，PP4中Desmin陽性反應的細胞約占90%。單位視野PP2、PP3、PP4的陽性細胞率分別為29.3%(454/1 550)、75.5%(657/870)、89.6%(448/500)，差異有統計學意義。

3.肌管的鑒定：Skeletal myosin為骨骼肌特有的功能蛋白，是肌衛星細胞分化形成肌管和成熟骨骼肌的標志。Cardiac troponin T是心臟特有的心肌蛋白，是存在于心肌肌原纖維中細肌絲上的收縮調節蛋白。主要調節心肌收縮過程中粗、細肌絲之間的相對滑行，近幾年來被用于鑒定間充質干細胞分化為心肌樣細胞的標志[9]。乙酰膽堿受體(AchRs)是骨骼肌發育過程中最早出現的膜蛋白。AchRs在肌纖維表面高濃度聚集表達被認為是分化為成熟骨骼肌纖維的標志，并伴隨著AchRs電生理的變化[10]。α-銀環蛇毒素特異性與神經肌肉接頭的N-AchR結合，阻斷Ach作用于乙酰膽堿受體，因此，可被用來鑒定骨骼肌細胞的乙酰膽堿受體。肌管經skeletal myosin和Cardiac troponin T免疫熒光染色呈陽性為紅色，DAPI染細胞核呈藍色(見圖2B、圖2C)。圖3顯示在培養第4天MDSCs分化為肌管后，用α-銀環蛇毒素-羅丹明染色后,在肌管表面呈紅色聚集成簇的乙酰膽堿受體表達，但在預先用乙酰膽堿孵育后，由于AchRs已與乙酰膽堿結合,再用α-銀環蛇毒素-羅丹明來染色，未見呈紅色團塊狀聚集的乙酰膽堿受體的表達。

討論

長期以來，肌組織的正常發育和修復全部歸功于肌衛星細胞，但這一結論被分離得到的一類多能干細胞打破，這類細胞被稱為側群干細胞。Bhagavati等[11]從肌組織中分離得到側群干細胞，將其注射到經過致死劑量射線照射后的小鼠血管內，發現此類細胞可以持續增殖并分化為幾乎所有類型的血細胞，證實了其自我更新和多潛能分化的能力，因而也被賦予MDSCs的名稱。對于肌衛星細胞的培養，受到的關注和研究較多，而MDSCs的培養在國內較少見。因此，本研究擬在體外培養乳鼠肌源干細胞，并探討其成肌分化的能力，為今后的細胞移植或基因治療提供種子細胞。

Dispase酶是一種中性蛋白酶，與分離細胞常用的胰酶相比，對細胞損害小，且它可以消化細胞外基質，有利于干細胞的釋放[12-13]。Qu-Petersen等[12]用膠原酶、Dispase酶、胰蛋白酶逐步消化從而分離MDSCs。與之不同，本實驗利用膠原酶、Dispase酶混合消化，簡化了操作步驟，且未使用胰蛋白酶，從而減少了對細胞的損傷。目前最常用的MDSCs純化方法主要有preplate[12]、密度梯度離心法[14]、流式細胞術、免疫磁珠法。Preplate即反復差速貼壁法，是根據成纖維細胞貼壁速度快，而MDSCs貼壁速度慢的特點,將成纖維細胞去除,提高MDSCs的純度。本實驗用此方法純化，得到的PP3、PP4從細胞形態上看可描述為兩類，一類頗似肌衛星細胞的短梭形，一類為小圓形。這與Qu-Petersen等[12]對肌源干細胞形態描述頗為相似。

MDSCs幾乎沒有特異性表面標志物，國內外大部分實驗室檢測Desmin(肌源性標志物)對其進行鑒定，本研究發現反復差速貼壁到PP4時，經Desmin鑒定純度達到近90%。

肌管形成是MDSCs成肌分化的標志，本實驗中除形態上的變化外，肌管同時表達了骨骼肌特異性蛋白Skeletal myosin、心肌特異性蛋白Cardiac troponin和骨骼肌的膜蛋白AchRs。Skeletal myosin和AchRs的表達說明MDSCs已向著成熟骨骼肌纖維分化，AchRs表達的鑒定在國內外的研究中較少見。有大量研究將Cardiac troponin作為嗅球[15]、骨髓[16]、脂肪等來源的間充質干細胞分化為心肌樣細胞的鑒定，本研究將其用于鑒定MDSCs成肌分化的一個標志，為以后的心肌疾病的細胞治療打下基礎。

肌管的自發性收縮現象，目前國內外均有報道，但對于這種現象產生的原因沒有定論。趙科研等[17]在收縮的細胞中加入終濃度為0.1 μmol/L的異丙腎上腺素(isoproterenol，IP)，結果發現加入IP后細胞收縮頻率比加入前平均增加約18.4次/分鐘，說明肌源干細胞表面可能有?受體的存在。本試驗在肌管培養過程中，也發現了肌管有自發性收縮現象。

綜上所述，本實驗采用混合酶消化法和preplate分離純化，成功地獲得了具有成肌分化能力的MDSCs，為骨骼肌疾病、心肌疾病、泌尿系統疾病的細胞治療奠定了基礎。

(圖2、圖3見封底)

1Takacs EB.The potential use of cytokines and stem cell homing signals in the treatment of stress urinary incontinence.J Urol,2007,177：1227-1228.

2肖菲,趙戰魁,劉波,等.兔骨骼肌干細胞向平滑肌細胞分化的實驗研究.武漢大學學報(醫學版),2013,34:209-212.

3Tang Y,He H,Cheng N,et al.PDGF,NT-3 and IGF-2 in combination induced transdifferentiation of muscle-derived stem cells into Schwann cell-like cells.Plos One,2014,9:e73402-e73402.

5Tsao J,Vernet DA,Gelfand R,et al.Myostatin genetic inactivation inhibits myogenesis by muscle-derived stem cells in vitro but not when implanted in the mdx mouse muscle.Stem Cell Res Ther,2013,4:1-19.

6Sekiya N,Tobita K,Beckman S,et al.Muscle-derived stem cell sheets support pump function and prevent cardiac arrhythmias in a model of chronic myocardial infarction.Mol Ther J Am Soc Gene Ther,2013,21:662-669.

7Hnia K,Ramspacher C,Vermot J,et al.Desmin in muscle and associated diseases:beyond the structural function.Cell Tissue Res,2015,360:591-608.

8Liu Y,Chen S,Li W,et al.Isolation and characterization of primary skeletal muscle satellite cells from rats.Toxicol Mech Method,2012,22:721-725.

9Chen Y,Wang C,Huang Q,et al.Caveolin-1 plays an important role in the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes.Cardiology,2016,136:40-48.

10Brenner HIL,Rotzler S，Kues WA，et a1．Nerve-dependent induction of AChR epsilon-subunit gene expression in muscle is independent of state of differentiation．Dev Biol，1994，165：527-536．

11Bhagavati S,Xu W.Isolation and enrichment of skeletal muscle progenitor cells from mouse bone marrow.Biochem Biophys Res Comm,2004,318:119-24.

12Qu-Petersen Z，Deasy B，Jankowski R，et al.Identification of a novel population of muscle stem cells in mice:potential for muscle regeneration.Cell Biol,2002,157:851-854

13Agley CC,Rowlerson AM,Velloso CP,et al.Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle.JoVE,2015,95:e52049-e52049.

14Che X,Guo J,Wang B,et al.Rapid isolation of muscle-derived stem cells by discontinuous Percoll density gradient centrifugation.In Vitro Cell Dev-An,2011,47:454-458.

15Huang Y,Li I,Chueh S,et al.Mesenchymal stem cells from rat olfactory bulbs can differentiate into cells with cardiomyocyte characteristics.J Tissue Eng Regen Med.2015，9:E191-E201.

16Xing Y,Lv A,Li W,et al.Engineered myocardial tissues constructed in vivo using cardiomyocyte-like cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells in rats.J Biomed Sci,2012,19:99-100.

17趙科研，俞世強，蔡振杰,等．大鼠成肌細胞體外培養及其自發收縮特性．第四軍醫大學學報，2004,25：34-36．