核磁共振氫譜檢測糖尿病不同發病階段額葉和枕葉的代謝變化

王丹，鄭涌泉，趙良才，鄭宏，高紅昌，張華杰

（1.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學醫學院附屬婦產科醫院 藥劑科，浙江杭州 310006）

核磁共振氫譜檢測糖尿病不同發病階段額葉和枕葉的代謝變化

王丹1，鄭涌泉2，趙良才1，鄭宏1，高紅昌1，張華杰1

（1.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學醫學院附屬婦產科醫院 藥劑科，浙江杭州 310006）

目的:運用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學方法分析1型糖尿病大鼠不同發病階段額葉和枕葉2個腦區的代謝變化。方法:取正常大鼠（n=22）和鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠發病1周（n=8）、5周（n=7）、9周（n=7）的額葉和枕葉組織進行1H NMR檢測，并結合多元模式識別和代謝物定量分析闡述代謝特征。結果:糖尿病發病各個時期，額葉和枕葉的代謝模式均發生顯著改變。與正常大鼠相比，代謝物乳酸（Lac）、牛磺酸（Tau）、肌醇（m-Ins）含量隨著糖尿病的發展明顯升高；而N-乙酰天冬氨酸（NAA）、天冬氨酸（Asp）、琥珀酸（Suc）等的含量顯著降低。結論:額葉和枕葉的代謝變化相似，且均發生于糖尿病早期，主要涉及能量代謝紊亂、谷氨酸-谷氨酰胺-γ-氨基丁酸（Glu-Gln-GABA）循環抑制、滲透壓調節增強。

糖尿病；能量代謝；額葉；枕葉；核磁共振氫譜；大鼠

糖尿病引起的中樞神經系統損傷日益受到關注[1]。糖尿病會導致腦萎縮和白質損傷，臨床上，腦萎縮和白質損傷通常被認為是糖尿病患者認知功能障礙的病理學基礎[2]。而糖尿病患者腦內額葉和枕葉萎縮與注意力下降和記憶力損傷密切相關[3]。然而，導致糖尿病腦損傷的發病機制目前仍不明確。

基于核磁共振的代謝組學技術在生命科學領域擁有重要地位和強大優勢[4-8]。本研究利用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學方法分析1型糖尿病大鼠不同發病階段額葉和枕葉2個腦區的代謝變化，找出具有時間依賴性和腦區特異性的特征代謝物和代謝途徑，為闡明糖尿病患者注意力和記憶力發生障礙的潛在發病機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑與動物 Bruker AVANCE I I I 600核磁共振譜儀（德國Bruker公司）；血糖試紙及血糖儀（德國貝朗醫療國際貿易有限公司）；冷凍干燥機（ALPHA-4，德國Christ公司）。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自美國Sigma-Aldrich公司；重水（D2O，99.9%）購于英國劍橋同位素實驗室；檸檬酸、檸檬酸鈉、甲醇、氯仿購于上海國藥集團化學試劑有限公司。Sprague-Dawley（SD）大鼠44只，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司動物合格證號:SCXK（滬）2012-0002，飼養在溫州醫科大學實驗動物中心SPF級動物房，并通過實驗動物倫理學委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 1型糖尿病模型的建立:大鼠適應性飼養1周后，隨機分為2組，即糖尿病組和對照組，各22只。大鼠禁食12 h后，糖尿病組腹腔注射STZ檸檬酸鈉混懸溶液（70 mg/kg，現配現用），72 h后測其血糖水平，空腹血糖值大于16.7 mmol/L的大鼠為造模成功的糖尿病大鼠。對照組注射同等劑量的檸檬酸鈉混懸溶液（0.1 mol/L，pH=4.5）。

1.2.2 腦組織（額葉和枕葉）樣本的收集和處理:大鼠在STZ誘導1周（n=8）、5周（n=7）、9周（n=7）后斷頭處死，快速分離出額葉和枕葉，并將收集的腦組織樣本迅速浸入液氮中急凍，置于-80 ℃保存。冰凍的腦組織樣本稱重后，置于勻漿管中，加入冰甲醇4 mL/g，蒸餾水0.85 mL/g，使用手持式組織勻漿機勻漿，渦漩15 s；再加入2 mL/g氯仿，渦漩；最后分別加入2 mL/g冰氯仿和冰蒸餾水，渦漩后于冰上靜置15 min。于1 000×g 4 ℃條件下離心15 min，取上層水溶性代謝物。凍干24 h，得到代謝物粉末。最后將粉末重新溶解于500 μL D2O中，離心（12 000×g，10 min，4 ℃），上清液轉入NMR樣品管中進行測試。

1.2.3 腦組織提取物的1H NMR檢測及數據處理:于600 MHz NMR波譜儀上進行NMR采集實驗，探頭溫度控制為25 ℃，累加采樣256次，采樣點數64 K，譜寬為12 000 Hz，弛豫延遲10 s。將采得的時域信號進行傅立葉變換后，使用Topspin 2.1軟件對所有的1H NMR譜圖進行相位校正、基線調整，并以乳酸的甲基峰的化學位移（1.33 ppm）定標[9]。所有譜圖用MATLAB軟件（R2012a，美國MathWorks公司）進行對齊處理[10]。將1H NMR譜從δ0.1～10.0 ppm按0.01 ppm為單位進行自動分段積分，為了消除預飽和壓水峰時引起的譜線扭曲，將δ5.16～4.70 ppm的水峰區域設為0積分段。對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將數據導入SIMCA-P+12.0軟件（瑞典Umetrics公司）進行偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）。所得得分圖是以第一和第二主成分作為x，y坐標軸構建的二維空間，該空間中每一個點代表一個樣本，圖中橢圓區域代表95%的置信區間。由PLS-DA得到的軌跡圖中，一個點代表各組某一個時間點的代謝輪廓。相應的彩色相關系數載荷圖（correlation coefficient color-coded loadings plot）上，橫坐標代表化學位移，縱坐標代表相關系數|r|值（0～1.0），表示各代謝物對組間分離的貢獻，|r|越大，即圖中峰顏色越偏向于暖色調，對組間分離的貢獻越大。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理，結果以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病發病不同時期的額葉和枕葉1H NMR譜及代謝模式分析 腦組織提取物的1H NMR波譜可以同時測量多種內源性代謝物，圖1和圖2分別為額葉和枕葉提取物的典型1D1H NMR譜，基于實驗室前期已發表的研究成果[6，11]及2D1H-1H COSY和TOCSY譜圖驗證，歸屬代謝物有乳酸（Lac，δ1.33，δ4.11）、丙氨酸（Ala，δ1.47）、N-乙酰天冬氨酸（NAA，δ2.01，δ4.39），γ-氨基丁酸（GABA，δ1.90，δ2.29）、谷氨酸（Glu，δ2.35，δ3.75）、琥珀酸（Suc，δ2.40）、谷氨酰胺（Gln，δ2.45，δ3.75）、天冬氨酸（Asp，δ2.82）、肌酸（Cre，δ3.03，δ3.93）、膽堿（Cho，δ3.20）、牛磺酸（Tau，δ3.42）、甘氨酸（Gly，δ3.55）和肌醇（m-Ins，δ3.52，δ4.06）。從代謝軌跡圖中可以看出額葉和枕葉2個腦區，糖尿病組和對照組在第一主成分方向上明顯區分，且糖尿病發展這一因素對代謝模式的影響遠大于大鼠自身生長發育這一因素對代謝模式的影響，見圖3A和4A。且2個腦區在糖尿病發病不同時期的代謝模式均明顯區分，見圖3B和4B。在額葉區，引起糖尿病組和對照組之間的差異的主要代謝物有:Lac、NAA、Gln、m-Ins；同樣的，這些也是引起枕葉區代謝差異的主要特征性代謝物，見圖3C和4C。

圖1 對照組1周（A）和糖尿病組1周（B）、5周（C）、9周（D）時大鼠額葉組織典型的1H NMR譜

圖2 對照組1周（A）和糖尿病組1周（B）、5周（C）、9周（D）時大鼠枕葉組織典型的1H NMR譜

2.2 代謝物定量分析結果 進一步對代謝物進行定量分析后發現，在糖尿病組1周時的大鼠額葉中，NAA、GABA、Gln、Cho含量明顯下降，m-Ins含量顯著升高，而枕葉中還存在Lac升高的現象。當糖尿病發展至5周時，在之前的基礎上，代謝變化逐漸加劇，額葉中的Lac開始顯著升高，枕葉中的Tau顯著升高。至第9周時，代謝變化持續加劇，Asp開始在2個腦區顯著降低，此外，額葉中的Tau開始出現升高的趨勢，枕葉中的Gly開始出現降低的趨勢，見表1。

2.3 Glu-Gln-GABA循環 糖尿病1周時，額葉和枕葉區均已開始出現Glu、Gln、GABA含量減少的趨勢。與對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠額葉和枕葉區，三者總含量（Glu+Gln+GABA）在1、5、9周時均持續降低，見圖5。

3 討論

圖3 額葉模式識別分析結果

圖4 枕葉模式識別分析結果

3.1 能量代謝紊亂 腦部能量需求至少占人體總能量需求的20%[12]，腦能量代謝紊亂與腦病的發生發展密切相關[13]。本研究發現，在糖尿病的發病進程中，額葉和枕葉中Lac含量均持續升高，而Lac在腦內是由能量底物葡萄糖通過無氧酵解方式代謝產生的，在糖尿病大鼠腦內的這種異常升高，說明無氧酵解途徑增強。同時，當糖尿病發展到第9周時，2個腦區中三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA循環）中間產物Asp和Suc均出現降低的趨勢，說明TCA循環活性減弱，可能是高糖刺激腦內神經細胞致使其線粒體受損，從而影響到正常的氧化呼吸供能。綜上所述，糖尿病誘導的無氧酵解過強導致無效供能增加，而發病后期TCA循環的減弱，進一步加劇了能量代謝紊亂。

3.2 神經元-膠質代謝區間改變 哺乳動物腦內存在2個主要代謝區間，分別是神經元代謝區間和膠質細胞代謝區間[6]，Glu-Gln-GABA循環在維持這2個代謝區間的神經遞質平衡以及大腦運作中起著至關重要的作用[10]。Glu被星形膠質細胞攝取后，在膠質內轉化為Gln，因為谷氨酰胺合成酶僅存在于膠質細胞中，隨后合成的Gln被轉運回神經元，作為氨基酸類神經遞質Glu和GABA的主要前體物質，繼續參與神經沖動傳遞或其他代謝途徑。本研究在2個腦區中同時發現Glu、Gln、GABA的含量有持續減少的趨勢，三者總含量隨著糖尿病的發生發展顯著降低，說明在糖尿病發病進程中，神經元和膠質細胞之間的這一重要循環受到阻礙，遞質動態平衡被打破。這一結果與本課題組早前在2型糖尿病模型db/db小鼠海馬內得到的Glu-Gln循環減弱的結果[7]一致。可見無論是1型還是2型糖尿病，高血糖造成的腦中神經元和膠質細胞間的遞質傳遞障礙普遍存在。此外，本研究還發現，從糖尿病1周開始，額葉和枕葉區就已開始出現Glu-Gln-GABA循環障礙的現象，且隨著糖尿病的發生發展持續減弱。有研究[3]表明糖代謝紊亂的早期就已觸發腦損傷，這種代謝水平觀測到的早期代謝異常，很可能是導致糖尿病患者逐漸發展演變為腦損傷的重要原因。

表1 糖尿病組大鼠腦中代謝物含量變化表

3.3 氨基酸類神經遞質代謝紊亂 m-Ins、Tau是反映膠質細胞增生或膠質細胞活性以及膠質滲透壓調節的特征性代謝物，主要參與調節滲透壓平衡和細胞內環境的穩定[14-15]。糖尿病1周大鼠額葉和枕葉中m-Ins的增加以及糖尿病發病后期Tau的升高表明2個腦區中膠質細胞滲透壓調節的需求增強。Cre的含量在2個腦區中一直維持穩定，這也與相關文獻[16-18]報道的腦內Cre含量在絕大多數疾病發生時一般恒定不變是相符的。此外，與對照組大鼠相比，額葉和枕葉中NAA從1周時開始顯著降低，與1型糖尿病患者額葉活體定域MRS結果[19-20]一致。而NAA作為神經元活性的特征性代謝物，其含量的降低說明神經元受損。結合上述分析，神經元受損可能是導致神經元和膠質細胞之間的Glu-Gln-GABA循環障礙的重要誘因。

3.4 腦區相似性 本實驗分別考察了大腦內參與調節注意力和記憶力的2個腦區—額葉和枕葉，在糖尿病發生發展進程中的一系列重要的神經化學物質的擾動。值得一提的是，在糖尿病發病進程中，2個腦區中發生變化的特征性代謝物基本一致，且隨著發病周期的增加具有規律性的持續降低或升高，比如Lac、NAA、m-Ins、Suc、Asp、Tau、Gly等。說明高血糖對額葉和枕葉造成的代謝紊亂是相似的，只是個別代謝物的擾動發生的時期略有差異，比如Lac的升高在額葉中至第5周才出現統計學差異，而在枕葉中第1周就顯著升高；額葉中的Tau在糖尿病造模9周后才出現明顯升高，而枕葉中發病第5周就具有統計學差異。這說明雖然額葉和枕葉在大腦內分布的具體位置不同，但是可能由于它們均參與調控注意力和記憶力，功能上相互協調，所以一旦受到外界刺激，會引起相似的代謝調控反應，這也進一步說明了高血糖可能會對注意力和記憶力造成損害，而且，這種損害在糖尿病發病早期（1周）時，就已經可以觀測到代謝水平的擾動。

圖5 糖尿病大鼠額葉和枕葉中Glu、Gln和GABA總含量柱狀圖

綜上所述，本研究應用基于1H NMR的代謝組學方法分析了1型糖尿病大鼠不同發病階段額葉和枕葉2個腦區的代謝水平的變化，結果發現，高血糖對額葉和枕葉在糖尿病各個時期的代謝輪廓均造成了較大程度的影響。從代謝物水平觀測到2個腦區中發生的特征性代謝物變化具有相似性，且多數代謝紊亂在糖尿病發病早期就已開始出現，隨著糖尿病的發生發展逐漸加劇，其中包括能量代謝出現紊亂、Glu-Gln-GABA循環受到抑制、滲透壓調節的增強等。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Study on frontal lobe and occipital lobe metabolism in different stages of diabetes using1H NMR spectros-

copy

WANG Dan1, ZHENG Yongquan2, ZHAO Liangcai1, ZHENG Hong1, GAO Hongchang1, ZHANG Huajie1.

1.School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Pharmacy, Women’s Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310006

Objective：To investigate the metabolic changes of frontal lobe and occipital lobe in different stages of diabetes.Methods：The frontal lobe and occipital lobe were dissected from the 1-week, 5-week and 9-week diabetic rats and the age-matched controls.1H NMR-based metabonomics combined with multivariate pattern recognition analysis and quantitative analysis were used to study the metabolic characteristics.Results：The metabolic patterns of frontal lobe and occipital lobe were signif cantly changed in different stages of diabetes. Compared to the controls, lactate, taurine and myo-inositol were distinctly increased both in frontal lobe and occipital lobe with the development of diabetes, while the levels of N-acetyl-aspartate, aspartate and succinate were markedly decreased.Conclusion：The metabolic changes in frontal lobe and occipital lobe are similar, and occurr in the early stage of diabetes. The metabolic changes mainly focus around the disordered energy metabolism, inhibit Glu-Gln-GABA cycle and increas osmoregulation.

diabetes mellitus; energy metabolism; frontal lobe; occipital lobe;1H NMR; rats

R34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.003

2016-05-17

浙江省藥學重中之重一級學科開放基金（YKFJ2-003）；浙江省自然科學基金資助項目（LY14H090014，LY15H180010）；高等學校博士學科點專項科研基金新教師類資助課題（20133321 120006）。

王丹（1991-），女，浙江嘉興人，碩士生。

張華杰，教授，碩士生導師，Email:zhanghuajie116@ sina.com。