二肽酶IV在胃癌中的表達及臨床意義

田杰，張志安，孫國興，肖保增，張文超，楊繼濤，張慶永，尹曉，耿國旺

（清河縣人民醫院 普外科，河北 邢臺 054899）

二肽酶IV在胃癌中的表達及臨床意義

田杰，張志安，孫國興，肖保增，張文超，楊繼濤，張慶永，尹曉，耿國旺

（清河縣人民醫院 普外科，河北 邢臺 054899）

目的:檢測二肽酶IV（DPP IV）在胃癌組織中的表達，探討其在胃癌預后中的價值。方法:收集本院手術后的胃癌組織及對應癌旁正常組織112例，用免疫組織化學方法定性比較胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中DPP IV的表達；Western blot定量比較胃癌組織及癌旁正常組織中DPP IV蛋白的表達。結果:免疫組織化學結果示DPP IV在癌旁正常組織中有3例（占2.7%）表達缺失；胃癌組織中有78例（占69.6%）表達缺失；Western blot結果示DPP IV在胃癌組織中的含量明顯低于癌旁正常組織；多因素分析示DPP IV是胃癌不良預后的獨立預測因子（P＜0.001）。結論:DPP IV表達缺失是胃癌不良預后的獨立預測因子。

二肽酶IV；胃腫癌；病理學；預后

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2003年1月至2014年12月在我院普外科行手術治療的胃腺癌組織及相應的癌旁正常組織112例，術前未經過放療及化療。納入標準∶入選病例均為原發性胃管狀腺癌根治標本。排除標準:胃鱗狀細胞癌、神經內分泌癌及腺癌活檢標本。記錄腫瘤部位、大小、組織學分級、浸潤深度及淋巴結和遠處器官轉移情況。所有胃腺癌標本均有完整的病理資料及隨訪資料，隨訪時間為手術日至死亡或末次隨訪日，所有死亡均與癌癥復發和轉移相關。DDP IV單克隆抗體購自丹麥DaKo生物試劑公司，相應二抗EnVision試劑盒購自北京博奧生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色:所有供體組織蠟塊行常規病理切片后HE染色，經有經驗的病理醫師采取雙盲法對112例胃腺癌組織切片進行復診及組織學分級確認。冰凍切片機5 μm厚連續切片制成冰凍切片。免疫組織化學染色操作嚴格按照試劑盒說明書進行，用正常大腸組織切片作陽性對照，PBS替代一抗作陰性對照，切片常規脫蠟，枸櫞酸鹽加熱抗原修復，然后采用EnVision兩步法進行免疫組織化學染色。結果判定:DDP IV染色以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性，采用半定量積分法判斷結果。根據染色強度評分:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據陽性細胞數所占百分比評分:＜10%為0分，11%～50%為1分，51%～75%為2分，＞76%為3分。兩項得分相乘，0～3分記為（-），4～5分記為（+），6～8分記為（++），≥9分記為（+++）。染色結果為陰性者，認為DDP IV表達缺失。

1.2.2 蛋白質提取及Western blot分析:經液氮超低溫保存的112例胃癌及癌旁正常組織用于提取蛋白質以進行Western blot分析。用放射免疫沉淀裂解液提取胃癌組織塊中的總蛋白，測定蛋白質濃度以判斷標本是否合格，取100 μg樣品上清液，聚丙烯酰胺凝膠電泳。4 ℃、100 mA穩流轉膜過夜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入DDP IV及β-actin（1∶400稀釋）一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加適量辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，于37 ℃孵育2 h，然后在暗室中顯影，底片經掃描儀透掃后用凝膠分析軟件Image Pro Plus對電泳結果進行灰階分析，以DDP IV與β-actin 的光密度比值表示其相對表達量。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計學軟件進行統計學分析，以χ2檢驗DDP IV的表達與胃癌臨床病理參數之間的相互關系；DDP IV在胃癌預后中的價值使用多因素Cox分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DPP4在胃癌中表達的免疫組織化學分析 DDP IV在癌旁組織中有3例（占2.7%）表達缺失，在胃癌組織中有78例（占69.6%）表達缺失（見圖1）。DDP IV蛋白表達與胃癌臨床病理參數之間的關系見表1，DDP IV的表達缺失與淋巴結轉移、肺轉移、浸潤深度及TNM臨床分期相關（P＜0.05）。伴有淋巴結及肺轉移者DDP IV的表達缺失的頻率增高，胃癌浸潤更深及TNM分期更晚者DDP IV的表達缺失的概率更大。

圖1 免疫組織化學結果示DDP IV的表達

表1 DPP IV表達與胃癌臨床病理參數之間的關系（例）

2.2 DDP IV在胃癌中表達的Western blot分析

Western blot結果顯示，癌旁正常組織中DDP IV的表達都明顯高于胃癌組織（P＜0.05），而且伴有轉移的胃癌組織中DDP IV的表達明顯低于無轉移的胃癌組織（P＜0.05），見圖2。

圖2 DDP IV的Western blot結果圖

2.3 DPP IV與胃癌臨床預后 根據隨訪結果，對DDP IV蛋白表達陽性組和表達缺失組的生存率進行了Kaplan Meier分析，結果見圖3。DDP IV陽性組患者的癌癥特異性生存率及癌癥無進展生存率明顯高于DDP IV表達缺失組，差異有統計學意義（P＜0.01）。經過多因素分析，結果顯示DDP IV表達缺失為胃癌患者不良預后的獨立危險因子，見表2。

圖3 DDP IV表達對生存率的Kaplan Meier分析

表2 胃癌預后因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

DPP IV是20世紀60年代末在大鼠腎臟中被發現的，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員[9]。DPP IV基因位于2號染色體，包括26個外顯子，表達于多種細胞表面，如淋巴細胞、黑色素細胞、腸上皮細胞等。DPP IV一般以同源二聚體形式存在，其單體含有766個氨基酸殘基，相對分子量11 kD，其細胞外區域具有蛋白酶活性，該酶能從絲裂因子或神經肽的N端切除二肽，從而使之失去活性。最初發現DPP IV是一種淋巴細胞分化分子[10]，在微生物感染等過程中具有免疫調節作用[11-12]；后來DPP IV被發現在多種腫瘤組織存在不同水平的表達降低[13-15]，并有進一步研究[16-19]發現其在腫瘤中起著抑制細胞增殖的作用；還有研究[20]報道DPP IV在鼻咽癌中也存在表達降低，并發揮著抑癌基因的作用。但也有研究發現DPP IV在肺癌[21]中表達升高，張夢真等[22]通過Western blot和RT-PCR實驗發現DPP IV在卵巢癌組織中表達明顯升高，并且與臨床分期、組織學分期與淋巴結轉移相關，從而推斷DPP IV參與了腫瘤的生長、浸潤和轉移。SANCHEZ-OTERO等[23]對肺癌等數種肺疾病組織在蛋白質和mRNA水平上對DPP IV進行了研究后發現其起著抑癌基因的作用，而且其發揮作用與p21密切相關。

本研究主要采用了免疫組織化學等常用的生物學實驗方法，結果發現DPP IV基本全部表達于正常的胃黏膜，而在胃癌組織中則不同程度地表達降低或缺失；而且隨著腫瘤惡性程度的增高，DPP IV的表達缺失更加明顯。進而通過Western blot方法分析發現:與正常胃黏膜組織相比，DPP IV在胃癌組織中的表達明顯降低，在伴有轉移的癌組織中其表達降低程度更大。DPP IV的表達缺失與胃癌浸潤深度及有無淋巴結及遠處臟器轉移有關，而與其病理學類型、組織學分化程度和年齡無關，這些數據提示DPP IV在胃癌的侵襲、轉移等過程中發揮了抑制作用。但是關于DPP IV在胃癌中的確切機制，目前研究較少，或是通過調控鉀通道的功能而影響腫瘤細胞的生長或存活而實現的，前者在細胞增殖、細胞周期的前進及凋亡中發揮著重要的作用。

本研究應用Kaplan Meier相關分析對實驗數據進行分析后發現，DPP IV的表達缺失與患者的癌癥特異性生存期及癌癥無進展生存期明顯相關；進而采用多因素Cox回歸分析后顯示DPP IV表達缺失是胃癌預后的獨立預測因子，通過檢測胃癌組織中DPP IV的表達水平可以預測患者以后的病情發展趨勢。因本研究為回顧性分析，且收集到的病例數較少，對DPP IV在胃癌中的作用缺少分子生物學水平上的研究、分析。但本研究初步發現了DPP IV在胃癌中發揮著抑癌基因的作用，DPP IV表達缺失是胃癌預后的獨立預測因子，而從基因水平上探討其作用機制應成為接下來研究的重點。

[1] 鄒文斌, 李兆申. 中國胃癌發病率及死亡率研究[J]. 中國實用內科雜志, 2014, 34(4): 408-415.

[2] CARCAS L P. Gastric cancer review[J]. J Carcinog, 2014, 13: 14.

[3] PIAZUELO M B, CORREA P. Gastric cancer: overview[J]. Colomb Med (Cali), 2013, 44(3): 192-201.

[4] ITOU M, KAWAGUCHI T, TANIGUCHI E, et al. Dipeptidyl peptidase -4: A key player in chronic liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(15): 2298-2306.

[5] ZHONG J, RAO X, RAJAGOPALAN S. An emerging role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4) beyond glucose control: potential implications in cardiovascular disease[J]. Atherosclerosis 2013, 226(2): 305-314.

[6] ZHENG T, BASKOTA A, GAO Y, et al. Increased plasma DPP4 activities predict new-onset hyperglycemia in Chinese over a four-year period: possible associations with inf ammation [J]. Metabolism, 2014, 64(4): 498-505

[7] LEE S A, KIM Y R, YANG E J, et al. CD26/DPP4 levels in peripheral blood and T cells in patients with type 2 diabetes mellitus[J]. J Cli Endocrinol Metab, 2013, 98(6): 2553-2561.

[8] 王忠民, 盧永科. DPPIV基因影響卵巢癌細胞生物學行為的機制探討[J]. 中國醫藥指南, 2011, 9(10): 29-32.

[9] KOIVISTO V. Discovery of dipeptidyl-peptidase IV——a 40 year journey from bench to patient[J]. Diabetologia, 2008, 51(6): 1088-1089.

[10] YU D M, SLAITINI L, GYSBERS V, et al. Soluble CD26/ dipeptidyl peptidase IV enhances human lymphocyte proliferation in vitro independent of dipeptidyl peptidase enzyme activity and adenosine deaminase binding[J]. Scand J Immunol, 2011, 73(2): 102-111.

[11] BROXMEYER H E, HOGGATT J, O’LEARY H A, et al. Dipeptidylpeptidase 4 negatively regulates colony-stimulating factor activity and stress hematopoiesis[J]. Nat Med, 2012, 18(12): 1786-1796.

[12] SHIOBARA T, CHIBANA K, WATANABE T, et al. Dipeptidyl peptidase-4 is highly expressed in bronchial epithelial cells of untreated asthma and it increases cell proliferation along with fibronectin production in airway constitutive cells[J]. Respir Res, 2016, 17: 28.

[13] KACER A, ARIKOK A T, KOKENEK UNAL T D, et al. Stromal expression of CD34, α-smooth muscle actin and CD26/DPPIV in squamous cell carcinoma of the skin: A comparative immunohistochemical study[J]. Pathol Oncol Res, 2012, 18(1): 25-31.

[14] NAZARIAN A , LAWLOR K, YI S S, et al. Inhibition of circulating dipeptidyl peptidase 4 activity in patients with metastatic prostate cancer[J]. Mol Cell Proteomics, 2014, 13 (11): 3082-3096.

[15] VARONA A, BLANCO L, PEREZ I, et al. Expression and activity prof les of DPP IV/CD26 and NEP/CD10 glycoproteins in the human renal cancer are tumor-type dependent[J]. BMC Cancer, 2010, 10: 193.

[16] BARREIRA DA SILVA R, LAIRD M E, YATIM N, et al. Dipeptidyl peptidase 4 inhibition enhances lymphocyte traff cking, improving both naturally occurring tumor immunity and immunotherapy[J]. Nat Immunol, 2015, 16(8): 850-858.

[17] OHNUMA K, HATANO R, MORIMOTO C, et al. DPP4 in anti-tumor immunity: going beyond the enzyme[J]. Nat Immunol, 2015, 16(8): 791-792.

[18] STULC T, SEDO A. Inhibition of multifunctional dipeptidyl peptidase-IV: Is there a risk of oncological and immunological adverse effects?[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2010, 88(2): 125-131.

[19] YU D M, YAO T W, CHOWDHURY S, et al. The dipeptidyl peptidase IV family in cancer and cell biology[J]. FEBS J, 2010, 277(5): 1126-1144.

[20] XIONG S, WANG Q, ZHANG L, et al. Identif cation of candidate molecular markers of nasopharyngeal Carcinoma by tissue microarray and in situ hybridization[J]. Med Oncol, 2011, 28(1): 341-348.

[21] WESLEY U V, TIWARI S, HOUGHTON A N. Role for dipeptidyl peptidase IV in tumor suppression of human non small cell lung carcinoma cells[J]. Int J Cancer, 2004, 109 (6): 855-866.

[22] 張夢真, 喬玉環, 索振河, 等. 卵巢上皮性癌組織中二肽基肽酶IV蛋白和mRNA的表達[J]. 鄭州大學學報, (醫學版), 2009, 44(5): 1099-1022.

[23] SANCHEZ-OTERO N, RODRIGUEZ-BERROCAL F J, DE LA CADENA M P, et al. Exalution of pleural effusion sCD26 and DPP-IV as diagnostic biomarkers in lung disease [J]. Sci Rep, 2014, 4(2): 3999.

（本文編輯：趙翠翠）

Expression of dipeptidyl peptidase IV gene in gastric carcinoma and its’ signifance for prognosis

TIAN

Jie, ZHANG Zhi’an, SUN Guoxing, XIAO Baozeng, ZHANG Wenchao, YANG Jitao, ZHANG Qingyong, YIN Xiao, GENG Guowang. Department of General Surgery, the People’s Hospital of Qinghe, Xingtai, 054899

Objective：To evaluate the expression of dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) in gastric carcinoma tissue and matched para-tumor tissues, then its clinical pathologic signif cance for gastric carcinoma was investigated.Methods：One hundred and twelve cases gastric carcinomas tissues and the same number of matched para-tumor tissues were selected, expressive difference of DPP IV gene between carcinoma tissues and their matched para-tumor tissues was measured by immunohistiochemistry; with protein concentration level of DPP IV measured by Western blotting methods.Results：The expressive loss number for DPP IV was 3 (2.7%) in 110 normal gastric tissues, while lossed in 78 gastric carcinomas; and the level of DPP IV decreased obviously in DPP IV positive tissues; DPP IV is an independent prognostic factor of gastric carcinoma by multiple factor analysis.Conclusion：Loss of DPP IV’s expression is an independent poor prognostic factor of gastric carcinoma.

dipeptidyl peptidase IV; stomach neoplasm; pathology; prognosis胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在東方國家發病率及病死率均居惡性腫瘤前列[1-3]；多數胃癌患者病情進展較快，預后不佳。有多項研究顯示二肽酶（dipeptidyl peptidase，DDP）家族參與了多種疾病的發生發展過程[4-8]，但是關于DDP IV在胃癌臨床病理學中的預后價值鮮有報道，本研究初步探討了DDP IV在胃癌預后中的價值。

R733.3

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.013

2016-03-05

田杰（1977-），男，河北清河人，主治醫師。