大白菜抗/感干燒心材料CNGCs編碼基因的差異解析

劉栓桃+張志剛+李巧云+王曉+王立華+趙智中+王淑芬+徐文玲+劉賢嫻+劉辰

摘要：在植物中，環腺苷酸門通道（CNGCs）蛋白由一個大的基因家族編碼，其參與K+、Na+ 和Ca2+等陽離子的非選擇性吸收和轉運，其中鈣離子（Ca2+）是植物生長發育必需的營養元素和信號調節因子。在大白菜中，Ca2+缺乏易造成干燒心的發生，不同大白菜品種對干燒心的易感程度存在顯著差異。本研究以極端抗/感干燒心大白菜自交系He102與06-247為試材，采用全基因組重測序的方法篩選到了6個編碼CNGCs的結構變異基因，分別是Bra003081、Bra022702、Bra032132、Bra024067、Bra021265、Bra031529，其分別與擬南芥CNGCs成員1、4、6、9、19、20同源。對6個大白菜CNGCs的潛在跨膜區進行了預測，發現這些CNGCs包含5～8個跨膜區域，C-端均位于胞質一側。對編碼蛋白氨基酸序列進行了比較，結果表明，來自06-247的Bra003081和 Bra031529的C-端分別缺失389個氨基酸殘基和多出43個氨基酸殘基；Bra032132和Bra024067的變異也發生在06-247中，它們的C-端發生了2～3個氨基酸殘基的插入或缺失；Bra021265和Bra022702的變異發生在He102中，前者是可變剪切，后者在N-端第31和第49氨基酸殘基處分別缺失和插入一個氨基酸殘基。易感干燒心材料06-247中四個突變CNGCs的突變位點都在編碼蛋白的C-端，這有可能影響CNGCs的功能。該試驗結果為下一步研究CNGCs基因功能、開發特異性標記、鑒定大白菜干燒心與CNGCs突變的關系奠定了基礎。

關鍵詞：大白菜；干燒心；環腺苷酸門通道；基因突變

中圖分類號：S634.101文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）03-0010-06

AbstractIn plants， cyclic-nucleotide gated channels （CNGCs） are non-selective cation channels encoded by a large gene family. They can uptake and transport most cations such as Na+， K+ and Ca2+， among which， Ca2+ plays pivotal roles in the physiology and biochemistry of all plants. Calcium deficiency often causes tip-burn in Chinese cabbage. Different genotypes of Chinese cabbage have obvious differences in the sensitivity to tip-burn. In this study， re-sequencing was conducted in two genotypes of Chinese cabbage inbred lines， He102 and 06-247， which showed significant differences in tip-burn reaction. Six genes coding for CNGCs were screened out and showed coding-region differences between two lines. They were Bra003081， Bra022702， Bra032132， Bra024067， Bra021265 and Bra031529， which showed homologous to Arabidopsis CNGC1， 4， 6， 9， 19， 20 respectively. The potential transmembrane domains were predicted. These CNGCs contained 5～8 transmembrane domains and their C-terminals were all located in the inside of cell membrane. Amino acid sequence alignment showed that， Bra003081 and Bra031529， which mutated in 06-247， showed C-terminal large fragment deletion and small fragment elongation respectively； Bra032132 and Bra024067， also mutated in 06-247， showed only 2 to 3 amino acid insertion or deletion in C-terminal region； the mutation of Bra021265 and Bra022702 appeared in He102， in which， Bra021265 was alternative-splicing mutation while Bra022702 was single amino acid insertion/deletion mutation in N-terminal region. All the mutations of CNGCs in 06-247 appeared in the C-terminal region， which might influence their functions. The results provided clues for studying gene function of CNGCs， developing site-specific markers and exploring their relations to tip-burn in Chinese cabbage.

KeywordsChinese cabbage； Tip-burn； Cyclic-nucleotide gated channels （CNGCs）； Gene mutation

鈣是植物必需的營養元素，其在細胞內以二價陽離子即Ca2+的形式存在，不僅對維持植物細胞壁和細胞膜結構的完整性至關重要，也是調節植物生長發育和應對環境脅迫的第二信使成分。Ca2+主要由植物的根系從土壤吸收，即主要經根尖及成熟區根毛的表皮穿越根的外皮層細胞進入內皮層，最后進入中柱，經質外體或共質體途徑運輸至地上部分。可見植物對Ca2+的吸收是個復雜過程，導致植物缺鈣的原因不僅有環境因素如土壤酸化、環境溫度等，更有植物自身的原因。唐文浩等[1]研究發現，不同辣椒品種對營養液中Ca2+濃度變化敏感程度有顯著差異，不敏感型品種在一定供Ca2+條件下，外界環境Ca2+營養水平的高低對辣椒果實Ca2+累積量無顯著影響，說明不敏感型品種對Ca2+營養環境變化耐性較高，自身調控能力強，推測與品種自身的Ca2+吸收特性有關。本課題組在多年大白菜品種比較試驗中觀察發現，同地塊不同大白菜品種，其干燒心程度存在顯著差異，有的品種在各種地塊上種植從不發生干燒心現象，而有的品種則在相同條件下年年出現干燒心。由此推測，不同干燒心易感程度的大白菜材料在鈣吸收和運輸系統中可能存在差異。在鈣的吸收轉運過程中，作為非選擇性陽離子通道（non-selective cation channels，NSCCs）重要組成的環腺苷酸門通道 （cyclic-nucleotide gated channels，CNGCs） 蛋白起重要的作用[2-5]。我們以兩個極端抗/感干燒心大白菜自交系為試材，采用全基因組重測序方法篩選編碼CNGC的差異基因，并對其進行詳細解析，旨在為下一步鑒定基因功能、開發功能性標記、采用QTL定位技術篩選與抗/感干燒心緊密連鎖的分子標記奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究所用材料為極端易感干燒心大白菜材料06-247，從日本大白菜一代雜交種健春的自交后代中分離；極端抗干燒心大白菜材料He102為地方品種河南二包頭后代的分離自交系。

1.2CNGCs結構差異基因的篩選

全基因組重測序委托百邁客公司進行，將兩材料間的差異基因按swissprot_annotation和GO_annotation功能注釋分別排序，篩選兩項內容中包含cyclic nucleotide-gated ion channel的變異位點，獲得變異基因的基因ID信息。

1.3CNGCs差異基因的電子克隆及序列比對

從網站 http：//brassicadb.org/brad/[6]下載大白菜全基因組序列信息，利用網站的search gene 功能獲得變異基因的物理位置，從大白菜基因組序列信息中將對應的基因序列拷貝到記事本文檔即完成對變異基因參考序列的電子化克隆。對應基因的編碼區參考序列直接從BRAD數據庫中下載獲得。變異基因的突變序列則根據重測序提供的變異信息手動修改完成。各種類型的序列比對均用DNAMAN軟件運行。

1.4CNGCs跨膜區預測

跨膜區預測在網站http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html上進行。

2結果與分析

2.1環腺苷酸門通道差異基因的篩選

按功能注釋排序后，發現了10個差異位點的注釋信息含cyclic nucleotide-gated channel或putative cyclic nucleotide-gated channel，對應6個基因，它們是Bra021265、Bra031529、Bra022702、Bra024067、Bra032132和Bra003081，分別位于A01、A02、A03、A04和A10五條染色體上。Bra022702是雙位點變異，Bra003081有四處變異位點，其余四個基因是單位點變異。變異類型有移碼突變、可變剪切、密碼子插入/刪除等。Bra021265和Bra022702的突變發生在He102中，其余4個基因的突變發生在06-247中（表1）。

2.2差異基因在抗/感干燒心材料間的序列比較

Bra021265是一個可變剪切類的變異基因，該基因編碼區參考序列全長2 229 bp，包含11個外顯子，編碼743個氨基酸殘基，與擬南芥CNGC19同源。He102的Bra021265在第六內含子與第七外顯子之間插入了一個堿基，該堿基位于第六內含子剪切受體位點，有可能影響基因的正常剪切。06-247與He102的Bra021265序列差異如圖1所示。

Bra031529基因編碼區參考序列長2 274 bp，包括11個外顯子，編碼758個氨基酸殘基，與擬南芥CNGC20同源。在06-247中，該基因編碼區第11個外顯子中插入了一個堿基A（圖2A），導致06-247的編碼產物發生移碼突變而不能正常終止。經軟件預測，變異后的基因在3′端非翻譯區126～128 bp之間有一個終止密碼子，致使突變基因編碼區長2 406 bp，編碼產物比參考基因長43個氨基酸殘基，差異主要在蛋白的C-端（圖2B）。

Bra022702包含8個外顯子，與擬南芥CNGC4同源。測序結果表明He102的Bra022702在第一外顯子處有兩處突變，在不足50 bp的范圍內同時缺失一個密碼子和插入一個密碼子（圖3A），而06-247沒有發生突變。二者編碼產物總氨基酸數目不變，都包含695個氨基酸殘基，變異區域介于第31～50個氨基酸殘基之間（圖3B），變異位于編碼蛋白的N端。

Bra024067的編碼區參考序列長2 136 bp，包括5個外顯子，與擬南芥CNGC9同源。基因變異發生在06-247中，在編碼區第658個密碼子后插入了3個密碼子（圖4A），導致其編碼產物比He102多3個氨基酸殘基（圖4B）。

Bra032132參考基因編碼區長2 238 bp，包含7個外顯子，編碼746個氨基酸殘基，與擬南芥CNGC6同源。突變發生在06-247中，在第680個密碼子后缺失了兩個密碼子（圖5A），導致變異基因少兩個氨基酸殘基（圖5B）。

Bra003081的參考基因編碼區長2 274 bp，包括6個外顯子，編碼產物長758個氨基酸殘基，與擬南芥CNGC1同源。四處變異均發生在06-247中，在不足20 bp的范圍內有四處移碼突變（圖6A），導致突變基因的編碼區長2 275 bp。移碼突變使翻譯產物提前終止，C-端缺失389個氨基酸殘基，只編碼產生含369個氨基酸殘基的蛋白（圖6B）。

2.3差異基因跨膜區預測

CNGCs屬于跨膜蛋白，本研究用在線軟件對差異基因的跨膜區進行了預測，這些基因分別有5～8個跨膜區不等，C-端位于胞質一側，長短不等。具有5～6個跨膜區的CNGC其膜內側區域較長，而具有8個跨膜區的CNGC則C-端較短。詳細結果見表2。

3討論與結論

植物對鈣的吸收轉運是個復雜的過程，一方面，植物對鈣的吸收受環境的影響，如土壤干旱、鹽堿化；另一方面，不同基因型的植物由于鈣吸收轉運基因的變異導致在相同環境下對鈣的吸收存在差異。后者在育種工作中意義較大。參與鈣吸收轉運的基因眾多，其中CNGCs是一類重要的非選擇性陽離子通道蛋白，參與植物Ca2+的吸收和轉運，也參與Na+、K+等一價陽離子的吸收和轉運。在植物中，人們已從大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等物種中克隆到CNGCs基因[7]。模式植物擬南芥CNGCs家族有20個基因（CNGC1～CNGC20）。CNGCs是一類跨膜的通道蛋白，C-端是調控區，位于膜內胞質一側，此區域既可被環核苷酸結合后激活，又可被鈣調素競爭結合后失活[8]。本研究從大白菜兩材料中發現了6個CNGCs變異基因，其中4個（Bra031529、Bra024067、Bra032132和Bra003081）的變異均造成C端結構變異，有可能影響其功能。尤其是Bra003081，與擬南芥CNGC1同源性最高，其C端有大段的缺失，這有可能導致其調控區完全喪失，從而影響其對Ca2+的轉運。因為有研究表明，擬南芥CNGC1在根部高水平表達，其功能缺失突變

造成地上部分Ca2+含量顯著少于野生型[9]。Bra022702、Bra032132、Bra024067分別與AtCNGC4、AtCNGC6和AtCNGC9同源，其中，AtCNGC4與AtCNGC6都有參與Ca2+轉運的報道[10，11]，AtCNGC9的功能研究未見報道。Bra021265和Bra031529分別與AtCNGC19和AtCNGC20具有較高的同源性，AtCNGC19在根部表達，而AtCNGC20則主要在葉脈周圍高水平表達[12]。

本研究篩選到的大白菜CNGCs結構變異基因，均可以根據其核酸序列的差異特點開發成一定類型的分子標記，用于研究雙親衍生群體中干燒心性狀的QTL定位，為下一步的深入研究奠定基礎。

參考文獻：

[1]唐文浩， 陳雪華， 鄺春蘭， 等.辣椒果實鈣吸收累積的基因型差異及其生理特征[J].植物營養與肥料學報， 2002， 8（3）：349-354.

[2]Demidchik V， Maathuis F J M. Physiological roles of nonselective cation channels in plants： from salt stress to signalling and development[J]. New Phytol.， 2007， 175： 387-404.

[3]Pinto E， Ferreira I M P L V O. Cation transporters/channels in plants： tools for nutrient biofortification[J]. Journal of Plant Physiology， 2015， 179： 64-82.

[4]吳巨友，薛亞男，張紹鈴. 植物環核苷酸門控離子通道基因的功能及其調控[J]. 西北植物學報， 2010， 30（8）：1716-1720.

[5]周衛， 汪洪.植物鈣吸收、轉運及代謝的生理和分子機制[J].植物學通報， 2007， 24 （6）： 762-778.

[6]Cheng F， Liu S， Wu J， et al. BRAD， the genetics and genomics database for Brassica plants[J]. BMC Plant Biol.， 2011， 11：136.

[7]Talke I N， Blaudez D， Maathuis F J， et al. CNGCs：prime targets of plant cyclic nucleotide signaling[J]. Trends of Plant Science， 2003，8（6）：286-293.

[8]Kaplan B， Sherman T， Fromm H. Cyclic nucleotide-gated channels in plants[J].FEBS Letters， 2007， 581（12）： 237-246.

[9]Kaupp U B， Seifert R. Cyclic nucleotide-gated ion channels[J].Physiol. Rev.， 2002， 82：769-824.

[10]Kimberley C， Thomas A D， Moeder W， et al. The Arabidopsis cyclic nucleotide-gated ion channels AtCNGC2 and AtCNGC4 work in the same signaling pathway to regulate pathogen defense and floral transition[J]. Plant Physiol.， 2013， 163（2）：611-624.

[11]Wang Y F， Munemasa S， Nishimura N， et al. Identification of cyclic GMP-activated nonselective Ca2+-permeable cation channels and associated CNGC5 and CNGC6 genes in Arabidopsis guard cells[J]. Plant Physiol.， 2013，163（2）：578-590.

[12]Kugler A， Khler B， Palme K， et al. Salt-dependent regulation of a CNG channel subfamily in Arabidopsis[J]. BMC Plant Biol.，2009， 9：140.