泌尿系統(tǒng)感染革蘭陰性桿菌的病原學(xué)分布及耐藥表型

李文波， 高 武， 王周寶， 楊婭婭， 張玉娟

·論著·

泌尿系統(tǒng)感染革蘭陰性桿菌的病原學(xué)分布及耐藥表型

李文波， 高 武， 王周寶， 楊婭婭， 張玉娟

目的探討甘肅省第二人民醫(yī)院2014－2015年泌尿系統(tǒng)感染革蘭陰性桿菌病原學(xué)及產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶菌株的檢出率和耐藥性，為臨床合理選用抗菌藥物提供依據(jù)。方法采用手工法和鑒定儀系統(tǒng)對菌種進(jìn)行鑒定，用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏檢測，采用三維試驗(yàn)進(jìn)行耐藥酶檢測，根據(jù)2012年CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。結(jié)果臨床泌尿系統(tǒng)感染分離出革蘭陰性菌987株，其中大腸埃希菌509株、腸桿菌屬細(xì)菌109株、銅綠假單胞菌104株、肺炎克雷伯菌98株、奇異變形桿菌92株、弗勞地枸櫞酸桿菌46株和其他革蘭陰性桿菌29株，分離率分別為51.6 %、11.0 %、10.5 %、9.9 %、9.3 %、4.7 %、2.9 %。共檢出單產(chǎn)ESBL菌株494株（50.1 % ），初篩試驗(yàn)檢出可疑產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌243株，經(jīng)三維試驗(yàn)確證產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌135株（13.7 %），同時(shí)產(chǎn)ESBL和AmpC酶菌株16株（1.6 %），產(chǎn)ESBL菌株以大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌為主，檢出率分別為79.6 %、34.6 %、37.8 %，未檢出金屬酶及KPC酶。革蘭陰性桿菌對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥情況嚴(yán)重，總耐藥率最低的是亞胺培南（0.02 %）、阿米卡星（10.6 %）、頭孢哌酮-舒巴坦（23.8 %）和呋喃妥因（25.2 %）。大腸埃希菌對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為89.8%、91.8 %，革蘭陰性桿菌對頭孢菌素有不同程度的耐藥。結(jié)論泌尿系統(tǒng)感染的病原菌主要以大腸埃希菌為主，產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的檢出率和耐藥率均很高，亞胺培南、阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦、呋喃妥因具有較強(qiáng)的體外抗菌活性。

革蘭陰性桿菌 ；泌尿系統(tǒng)感染； β內(nèi)酰胺酶 ；抗菌藥物；耐藥率

泌尿系統(tǒng)感染發(fā)生率僅次于呼吸系統(tǒng)感染。尿頻、尿急、尿痛及排尿困難等是其臨床常見的主要癥狀，嚴(yán)重者可引發(fā)腎損傷或發(fā)展為血流感染。老年及有基礎(chǔ)疾病、女性尿道解剖結(jié)構(gòu)、長期住院、臥床等為易感因素[1-2]。革蘭陰性桿菌是泌尿系統(tǒng)感染的常見病原菌，隨著β內(nèi)酰胺類抗生素廣泛使用。細(xì)菌耐藥越來越嚴(yán)重，耐藥菌株不斷增加，呈現(xiàn)多重耐藥趨勢[3]。產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性桿菌最重要的耐藥機(jī)制。其中主要為染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)的持續(xù)高產(chǎn)Ⅰ型β內(nèi)酰胺酶（AmpC酶）和Ⅱ型中的超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）[4]。動(dòng)態(tài)監(jiān)測泌尿系統(tǒng)感染病原菌分布及產(chǎn)酶耐藥情況，可幫助臨床醫(yī)師了解本地區(qū)細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀及變遷，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 對本院2014－2015年送檢的臨床尿標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，菌種鑒定按第3版《臨床微生物學(xué)和微生物檢驗(yàn)》[5]進(jìn)行分離，并鑒定到種，共分離出菌株 987株。

1.1.2 儀器和培養(yǎng)基 微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司全自動(dòng)微生物鑒定儀），MH培養(yǎng)基購于杭州天河微生物試劑有限公司。

1.1.3 抗菌藥物紙片 頭孢唑林、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢哌酮、頭孢哌酮-舒巴坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢西丁、 亞胺培南、呋喃妥因、哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星均由杭州天河微生物試劑有限公司提供，經(jīng)質(zhì)控檢驗(yàn)合格使用。

1.1.4 質(zhì)控菌株 藥敏試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌 ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603（ESBL陽性質(zhì)控菌）均購于甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 分離及菌株鑒定 接種血平皿、麥康凱平皿，35?℃孵育24 h分純菌落，根據(jù)革蘭染色、生化反應(yīng)等進(jìn)行鑒定，必要時(shí)用微生物鑒定儀鑒定。泌尿道感染判斷標(biāo)準(zhǔn)：清潔尿培養(yǎng)革蘭陰性桿菌菌落計(jì)數(shù)≥105cfu / mL。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 耐藥酶檢測及藥敏結(jié)果均按CLSI 2012標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[6]。

1.2.3 耐藥酶檢測

1.2.3.1 酶粗提液制備[7]待測菌于肉湯中增菌，接種于MH培養(yǎng)基37?℃孵育24 h，刮取菌落于生理鹽水中制成菌懸液，-20?℃反復(fù)凍融5次后，12 000 r / min離心60 min取上清液即為β內(nèi)酰胺酶粗提液。用頭孢硝噻吩紙片檢測β內(nèi)酰胺酶，紙片變紅即為陽性。

1.2.3.2 采用改良三維法 三維試驗(yàn)[8]，將可疑的待測菌挑取于肉湯中，凍融5次；在涂抹了大腸埃希菌ATCC 25922的MH平皿上貼頭孢噻肟藥敏紙片1張，用刀片在其周圍切4個(gè)切口分別編號(hào)，1號(hào)切口中加入凍融后的酶粗提液30 μL，2號(hào)切口加入30 μL酶粗提液和10 μL克拉維酸液（2 mmol / L），3號(hào)切口加入30 μL酶粗提液和10 μL氯唑西林液（2 mmol / L），4號(hào)切口加入30 μL酶粗提液和10 μL氯唑西林液（2 mmol / L）和10 μL克拉維酸液（2 mmol / L），37?℃孵育24 h后，觀察切口內(nèi)側(cè)周圍有無細(xì)菌生長。若在切口與頭孢噻肟藥敏紙片的交界處出現(xiàn)矢狀細(xì)菌生長判為三維試驗(yàn)陽性。若此處不出現(xiàn)矢狀細(xì)菌生長判為三維試驗(yàn)陰性。

1.2.3.3 三維試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷 根據(jù)ESBL能被酶抑制劑克拉維酸抑制，不被氯唑西林抑制；而AmpC酶則不能被酶抑制劑克拉維酸抑制，能被氯唑西林抑制 ，1、2號(hào)陽性，3、4號(hào)陰性為單產(chǎn)AmpC酶，1、3號(hào)陽性，2、4號(hào)陰性為單產(chǎn)ESBL，1、2、3號(hào)陽性，4號(hào)陰性為產(chǎn)ESBL+AmpC酶，1、2、3、4號(hào)均陰性為不產(chǎn)酶。如圖1所示。

2 結(jié)果

2.1 革蘭陰性桿菌構(gòu)成

臨床泌尿系統(tǒng)感染革蘭陰性菌主要以大腸埃希菌為主，占總分離率51.6 %，分離前5位菌分別是大腸埃希菌、腸桿菌屬細(xì)菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌 。見表1。

圖1 改良三維試驗(yàn)Figure 1 Modifed three-dimensional test to detect betalactamases

表1 革蘭陰性桿菌分布Table 1 Distribution of the gram-negative bacilli isolated from urinary tract infections

2.2 革蘭陰性桿菌產(chǎn)酶菌株檢測

革蘭陰性桿菌中，檢出產(chǎn)ESBL菌株以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌為主，分別占各自分離菌的79.6 %、37.8 %、34.6 %，總檢出率為50.1 %。初篩試驗(yàn)（頭孢西丁藥敏紙片抑菌圈直徑＜16 mm）檢出可疑產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌243株，經(jīng)三維試驗(yàn)確證單產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌135株，以銅綠假單胞菌、腸桿菌屬細(xì)菌、弗勞地枸櫞酸桿菌為主，銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBL+AmpC酶16株，見表2。

表2 革蘭陰性桿菌產(chǎn)酶菌株檢測Table 2 Profle of ESBLs and AmpC beta-lactamases production in the gram-negative bacteria isolated from urinary tract infections

2.3 革蘭陰性桿菌耐藥率

革蘭陰性桿菌對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性嚴(yán)重，總耐藥率最低的是亞胺培南、阿米卡星、頭孢哌酮-舒巴坦、呋喃妥因，耐藥率分別為0.02 %、10.6 %、23.8 %、25.2 %。大腸埃希菌對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率為89.8%、91.8 %，革蘭陰性桿菌對頭孢菌素有不同程度的耐藥， 見表3。

3 討論

泌尿系統(tǒng)感染是臨床常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致血流感染，腎功能不全，住院期間經(jīng)常導(dǎo)尿、持續(xù)導(dǎo)尿、留置導(dǎo)尿管患者尤其容易發(fā)生尿路逆行感染[9]。本研究泌尿系統(tǒng)感染中大腸埃希菌的分離率最高，達(dá)51.6 %。隨著新藥的出現(xiàn)和大量頻繁使用，大多數(shù)菌株耐藥率逐年增加，并出現(xiàn)了大量產(chǎn)酶菌株，產(chǎn)ESBL革蘭陰性桿菌感染一直是泌尿系統(tǒng)感染治療中的難點(diǎn)。產(chǎn)ESBL細(xì)菌存在于革蘭陰性桿菌中，多見于腸桿菌科細(xì)菌[10]。 本院泌尿系統(tǒng)感染患者987株革蘭陰性桿菌中，產(chǎn)ESBL菌株檢出率為50.1 %（494 / 987），以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌為主，檢出率占各自菌的79.6 %、37.8 %、34.6 %。產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌檢出率為13.7 %（135 / 987），其中銅綠假單胞菌為63.5 %、腸桿菌屬細(xì)菌為49.5 %、弗勞地枸櫞酸桿菌為17.4 %，未檢出金屬酶及KPC酶。各地區(qū)產(chǎn)耐藥酶的細(xì)菌分離率不盡相同，應(yīng)加強(qiáng)對所有革蘭陰性桿菌進(jìn)行耐藥酶的檢測。產(chǎn)ESBL菌株對大多數(shù)抗菌藥物耐藥，尤其對 β內(nèi)酰胺類抗生素顯示高度耐藥，對氨基糖苷類、喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率也較高，治療十分困難。在體外藥敏試驗(yàn)中，亞胺培南、頭孢哌酮-舒巴坦、氨基糖苷類藥物、呋喃妥因、頭孢西丁對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌均有很強(qiáng)的抗菌活性，腸桿菌屬細(xì)菌、銅綠假單胞菌對頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢西丁的耐藥率稍高，是因?yàn)槠洚a(chǎn)AmpC酶比例較高的緣故，產(chǎn)AmpC酶菌株對所有第三代頭孢菌素類及酶抑制劑類藥物100 %耐藥。大腸埃希菌對頭孢菌素、喹諾酮類抗菌藥物的敏感率明顯下降，對頭孢菌素類藥物耐藥率均高于80 %，對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率在89.8 %～91.8 %。銅綠假單胞菌對常用抗菌藥物的耐藥率較高，除亞胺培南、阿米卡星外，對其余抗菌藥物的耐藥率＞40 %。因此，在治療泌尿系統(tǒng)感染時(shí)，必須及時(shí)送檢標(biāo)本進(jìn)行病原菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，做到合理規(guī)范使用抗菌藥物，重視產(chǎn)ESBL和AmpC酶菌株的監(jiān)測情況，定期對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，及時(shí)與臨床溝通，采取有效措施減少耐藥菌株的傳播。

表3 主要革蘭陰性桿菌對常用抗菌藥物的耐藥率Table 3 Resistance rate of gram-negative isolates to commonly used antimicrobial agents [n（ %）]

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Antimicrobial resistance profile of the gram-negative bacilli isolated from urinary tract infections

LI Wenbo, GAO Wu, WANG Zhoubao, YANG Yaya, ZHANG Yujuan. （Department of Laboratory Medicine, the Second People's Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China）

ObjectiveTo investigate the antimicrobial resistance and beta-lactamase production profle in the gram-negative bacilli isolated from urinary tract infections in the Second People’s Hospital of Gansu Province during the period from 2014 to 2015. The results will provided to clinicians for better antimicrobial treatment.MethodsThe bacterial isolates were identifed via conventional laboratory tests or automatic identifcation systems and subjected to antimicrobial susceptibility testing by using Kirby-Bauer method. Three-dimensional test was used to detect the enzymes conferring antimicrobial resistance. The susceptibility testing results were interpreted according to the CLSI breakpoints issued in 2012.ResultsA total of 987 gram-negative strains were isolated from urinary tract infections, including E. coli (51.6 %, 509 / 987), Enterobacter (11.0 %, 109 / 987), P. aeruginosa (10.5 %, 104 / 987), K. pneumoniae (9.9 %, 98 / 987), P. mirabilis (9.3 %, 92 / 987), C. freundii (4.7 %, 46 / 987), and other gram-negative bacilli (2.9 %, 29 / 987). ESBLs were produced in 494 (50.1 %) of the 987 strains of gram negative bacilli. Preliminary screening test identifed 243 AmpC beta-lactamases producing strains, and 135 (13.7 %) strains were confrmed by three-dimensional test. Both ESBLs and Amps beta-lactamases were produced in 16 (1.6 %) strains. The prevalence of ESBLs-producing strains was 79.6 % in E. coli, 34.6 % in P. aeruginosa and 37.8 % in K. pneumoniae isolates. Metallo-β-lactamase or KPC beta-lactamase was not identifed. The antimicrobial resistance was serious in gramnegative bacilli, which showed relatively low resistance rate to imipenem (0.02 %), amikacin (10.6 %), cefoperazone-sulbactam (23.8 %), and nitrofurantoin (25.2 %). E. coli prevalence of levofoxacin, ciprofoxacin resistance respectively were 89.8%, 91.8%. The gram-negative bacilli from urinary tract also showedvarious levels of resistance to cephalosporins.ConclusionsThe gram-negative bacilli isolated from urinary tract infections are mainly E. coli. The gram-negative isolates show high level antimicrobial resistance and high prevalence of beta-lactamases. Imipenem, amikacin, cefoperazone-sulbactam, and nitrofurantoin still have very high antibacterial activity against these isolates in vitro.

gram negative bacilli; urinary tract infection; beta-lactamase; antibacterial agent; antimicrobial resistance

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 02-0167-04

10.16718 / j.1009-7708.2017.02.009

2016-05-20

2016-08-17

甘肅省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，蘭州 730000。

李文波（1968—），女，本科，副主任檢驗(yàn)技師 , 主要從事微生物感染學(xué)研究。

李文波，E-mail：lwbcz2015@sina.com。