四神丸對脾腎陽虛泄瀉大鼠胃腸運動及Ghrelin的影響

李霞，劉富林，卿龍麗，鄧娜，藺曉源

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007; 3.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

實驗研究

四神丸對脾腎陽虛泄瀉大鼠胃腸運動及Ghrelin的影響

李霞1，劉富林1，卿龍麗1，鄧娜1，藺曉源2，3*

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007; 3.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

目的:觀察四神丸對脾腎陽虛型泄瀉模型大鼠胃腸運動及Ghrelin的影響。方法:將72只SPF級SD大鼠隨機分為正常組、模型組、得舒特、四神丸高、中、低劑量組，每組12只。除正常組外，其余各組均采用灌服腺嘌呤和番瀉葉水煎劑復制脾腎陽虛型泄瀉大鼠模型。給藥14 d后觀察各組大鼠一般狀態、腹瀉指數、胃腸運動及血清Ghrelin含量變化。結果:模型組大鼠一般狀態雖有所改善但腹瀉仍持續存在，且胃殘留率、小腸推進率及血清Ghrelin含量與正常組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。四神丸各劑量組、得舒特組上述指標均較模型組有所改善(P＜0.05或P＜0.01)。且四神丸高劑量組胃內殘留率和小腸推進率明顯優于其他各給藥組(P＜0.05)，四神丸高劑量組血清Ghrelin含量明顯優于中、低劑量組(P＜0.05)。而四神丸中、低劑量組的胃內殘留率和小腸推進率、以及高、中劑量組血清Ghrelin含量與得舒特組比較差異均不顯著(P＞0.05)。結論:四神丸能有效緩解脾腎陽虛泄瀉大鼠癥狀，以高劑量組效果為佳，其作用機制可能與調節胃腸運動及血清Ghrelin水平有關。

四神丸;泄瀉;脾腎陽虛;胃排空;腸推進;Ghrelin

腹瀉型腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome with diarrhea，IBS-D)是最常見的功能性胃腸病之一，臨床以腹瀉、腹痛為主要癥狀，可持續或間歇發作［1］，屬于中醫“泄瀉”的范疇。而基于“脾腎相關”理論的四神丸是臨床治療脾腎陽虛泄瀉之名方，但其作用機制未明。胃促生長素(Ghrelin)是基于腦腸互動調節胃腸運動的重要腦腸肽之一。因此，本實驗采用病證結合的動物模型，觀察了四神丸對脾腎陽虛泄瀉大鼠胃腸運動及血清Ghrelin含量的影響，現將結果報告如下。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級大鼠SD大鼠72只，雄性，體質量(200±20)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號:SCXK(相)2013-0004。

1.2 實驗藥物

四神丸(北京同仁堂天然藥物(唐山)有限公司，批號14080012，規格:27 g/瓶)，研碎后過篩，用蒸餾水配制、濃縮成0.732 g/mL、0.366 g/mL、0.183 g/mL的混懸液放入4℃冰箱備用。得舒特(匹維溴銨片，法國蘇威制藥公司，規格:50 mg/片)，研碎后過篩，配制成1.523 mg/mL的藥液備用。腺嘌呤(Solarbio，Lot.No.617D051，規格:10 g/瓶)，配制成0.02 g/mL的懸濁液。番瀉葉(購于老百姓大藥房，符合《中國藥典》標準)，冷水浸1 h后加水煮沸約10 min，過濾濃縮成1.0 g/mL的藥液。

1.3 主要試劑與儀器

［2］制備營養性半固體糊，密度為1 g/mL，冰箱冷藏，用時恢復至室溫。大鼠 Ghrelin ELISA試劑盒(美國RD公司);Enspire多功能酶標儀(美國Perkinelmer);Lynx6000落地式高速離心機(美國ThermoFisher);AUW120D精密電子天平(日本島津)。

2 方法

2.1 動物造模

參考文獻［3-6］造模，每只大鼠給予0.2 g/kg的腺嘌呤灌胃4周;并單日、雙日交替喂養甘藍(10 g/只)和精煉豬油(2 mL/只)，從第3周起再灌服冰番瀉葉水浸劑(10 mL/kg)2周。

2.2 分組與給藥

所有動物適應性喂養1周后，先根據體質量用Excel表隨機數字法取12只作為正常組，不予造模，其余60只造模后再隨機分為模型組、得舒特組、四神丸高、中、低劑量組，每組12只。四神丸高、中、低劑量組動物每日按7.32 g/kg、3.66 g/kg、1.83 g/kg灌胃(分別相當于成人等效劑量的4、2、1倍)，模型組給予等容量蒸餾水，得舒特組按15.23 mg/kg給予得舒特水溶液，正常組常規喂養。給藥14天。

2.3 指標檢測

2.3.1 一般狀態

給藥期間觀察各大鼠的精神、活動、毛發、飲食量、體質量、二便等一般狀態。

2.3.2 腹瀉指數

記錄給藥前后各組大鼠排稀便數量、次數、糞便直徑等腹瀉情況，并計算腹瀉指數。腹瀉指數=稀便率×平均稀便級。稀便率指每只大鼠所排稀便數與總便數之比;稀便級是以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小分4級，標準如下:污跡直徑＜1 cm為l級，1～2 cm為2級，2～3 cm為3級，＞3 cm為4級。

平均稀便級=稀便級數總和/稀便次數［4］

2.3.3 胃腸運動檢測

給藥第13 d，各組大鼠禁食(自由飲水)24 h后末次給藥，給藥后1 h灌胃給予半固體糊(2 mL/只)，15 min后10%水合氯醛麻醉，心臟采血后迅速打開腹腔，并用細線結扎胃幽門和賁門，然后取出胃和小腸(上端至幽門，下端至回盲部)。胃用濾紙擦干后稱得胃全重，然后沿胃大彎側剪開胃體，洗去胃內容物后擦干稱重得胃凈重，然后計算胃殘留率。胃殘留率(%)=(胃全重-胃凈重)/灌胃量×100%。測自幽門至碳末推進最前端的距離(推進長度)及幽門至盲腸根部的總距離(總長度)，并計算小腸推進率。小腸推進率(%)=(推進長度/總長度)×100%［7］。

2.3.4 血清Ghrelin含量檢測

大鼠麻醉后心臟采血，4℃ 離心(3 000 rpm) 15 min，取上層血清置于-20℃冰箱保存待測。采用ELISA法檢測血清Ghrelin含量。

2.4 統計學處理

所有數據采用SPSS19.0統計學軟件進行處理。計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。

3 結果

3.1 各組大鼠一般狀態變化

正常組大鼠精神狀態佳，活動迅速、反應靈敏、毛發光澤，飲食飲水、二便正常，體質量也保持一定的增長。造模組大鼠從造模第2周起出現精神不振、反應遲鈍、活動也明顯減少、毛發逐漸枯萎、大便稀軟、小便量增加，體質量下降;第3周起飲食減少、爪甲色淡、倦怠嗜臥、蜷縮喜扎堆、尾巴變涼、大便稀溏甚者有水樣便，且大便次數增多、肛周污穢、體質量下降明顯。給藥后模型組大鼠上述部分癥狀雖然有輕微好轉，但大便清稀一直存在;另外該組1只大鼠因極度消瘦死亡。四神丸高、中、低劑量組和得舒特組大鼠給藥l周后，上述癥狀均有不同程度的緩解，主要表現在活動和飲食增多，糞便次數減少且成形;四神丸高、低劑量組和得舒特組均有1只大鼠因灌胃不當死亡。

3.2 各組大鼠腹瀉指數變化

給藥前四神丸高、中、低劑量組、得舒特組與模型組的腹瀉指數比較差異不顯著(P＞0.05)。給藥后四神丸高、中、低劑量組和得舒特組的腹瀉指數均明顯低于模型組(P＜0.05)，其中又以四神丸高劑量腹瀉指數下降最為明顯(P＜0.01)。見表1。

3.3 各組大鼠胃腸運功變化

與正常組比較，模型組大鼠胃殘留率降低、小腸推進率升高，差異均有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，四神丸各劑量組和得舒特組均可不同程度的抑制大鼠胃排空及小腸推進(P＜0.05或P＜0.01)，且四神丸高劑量組明顯優于其他各給藥組(P＜0.05)，而四神丸中、低劑量組與得舒特組比較差異不顯著(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠腹瀉指數比較(±s)

表1 各組大鼠腹瀉指數比較(±s)

注:與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

組別 n 給藥前 給藥后正常組12 0 0模型組 11 1.34±0.18 1.31±0.11得舒特組 11 1.33±0.14 1.03±0.13△四神丸低劑量組 11 1.34±0.11 0.98±0.17△四神丸中劑量組 12 1.35±0.15 0.96±0.18△四神丸高劑量組 11 1.33±0.13 0.94±0.12▲

表2 各組大鼠胃殘留率和小腸推進率比較(±s，%)

表2 各組大鼠胃殘留率和小腸推進率比較(±s，%)

注:與正常組比較，☆P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01;與四神丸高劑量組比較，#P＜0.05。

組別 n 胃殘留率 小腸推進率正常組12 45.36±7.44 57.35±8.02模型組 11 25.89±5.14☆75.89±11.87☆得舒特組 11 34.43±5.13△#65.57±9.21△#四神丸低劑量組 11 30.37±4.64△#69.26±10.26△#四神丸中劑量組 12 35.06±6.09△#64.32±8.07△#四神丸高劑量組 11 47.27±8.56▲55.62±7.23▲

3.4 各組大鼠血清Ghrelin含量變化

與正常組比較，模型組 Ghrelin含量顯著增高(P＜0.01);各給藥組 Ghrelin含量均較模型組降低(P＜0.05或P＜0.01);四神丸高劑量組明顯優于中、低劑量組(P＜0.05)，四神丸低劑量組與得舒特組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，而四神丸高、中劑量組與得舒特組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清Ghrelin含量比較(±s，pg/mL)

表3 各組大鼠血清Ghrelin含量比較(±s，pg/mL)

注:與正常組比較，#P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01;與四神丸高劑量組比較，*P＜0.05;與得舒特組比較，☆P＜0.05。

組別n Ghrelin正常組12 1139.64±270.76模型組 11 1668.42±233.59#得舒特組 11 1323.67±275.28△四神丸低劑量組 11 1455.21±232.37△＊☆四神丸中劑量組 12 1361.52±259.13△＊四神丸高劑量組 11 1236.18±261.09▲

4 討論

泄瀉病位在腸，脾失健運是其關鍵，同時與腎臟密切相關。如《景岳全書》所言:“腎為胃關，開竅于二陰，……今腎中陽氣不足，則命門火衰……即令人洞泄不止也”。遵益火補土法，治當溫腎健脾。脾和腎是中醫藏象學說中非常重要的兩個臟器，是中醫先后天之本的精髓。脾為后天之本，腎為先天之本，二者在生理病理上均密切相關。在生理上，脾腎相互依存、相互制約;在病理上，脾病及腎、腎病及脾、脾腎同病。有研究表明［8］，脾腎相關的病理證候是脾腎陽虛證，而四神丸則是治療脾腎陽虛泄瀉的經典方，臨床用于治療IBS-D效果顯著［9］。我們前期研究發現，四神丸湯劑對脾腎陽虛泄瀉模型大鼠的作用可能與調節細胞因子TNF-α、IL-2、IL-4和外周血T細胞亞群水平有關［10-11］。

Ghrelin作為最常見的腦腸肽之一，是日本科學家Kojima等首先在大鼠胃黏膜及下丘腦發現的一種腦腸肽，由28個氨基酸組成，是迄今發現的唯一生長激素釋放激素受體的內源性配體。Ghrelin及其受體主要在胃、腸道、下丘腦和垂體分布。目前已有大量文獻證明Ghrelin在消化系統生理病理機制中占有重要地位［12-13］。研究表明，Ghrelin的結構與功能與胃動素具有相關性，有促進胃腸蠕動的作用［7］。我們的前期研究也發現，胃腸運動功能障礙小鼠血清Ghrelin水平降低［14］。同時，通過臨床觀察我們也發現功能性消化不良特別是餐后不適綜合征患者血漿Ghrelin水平與患者臨床癥狀輕重呈負相關［15］。

本實驗中，模型組大鼠一般狀態雖有所改善但腹瀉仍持續存在，而胃殘留率的降低、小腸推進率的升高，以及血清Ghrelin含量的增加，均提示模型大鼠胃腸動力出現亢進狀態。經用藥后四神丸各劑量組上述指標均較模型組有所改善(P＜0.05或P＜0.01)，說明四神丸作用于模型大鼠效果明確。而四神丸高劑量組為胃腸運動和血清Ghrelin水平的調節明顯優于中、低劑量組(P＜0.05)，表明四神丸具有一定的劑量依賴性，以高劑量效果為佳。但四神丸中、低劑量組的胃內殘留率和小腸推進率、以及高、中劑量組血清Ghrelin含量與得舒特組比較差異均不顯著(P＞0.05)，提示四神丸對該模型大鼠的作用在中劑量上與西藥得舒特效果相當。此外，以上結果還表明，四神丸可能通過調節血清腦腸肽Ghrelin的水平、抑制胃腸蠕動而達到止瀉的目的，但其調節Ghrelin的具體分子機制仍需深入研究。

參考文獻:

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Effect of Sishen Pill on the Gastrointestinal Motility and Ghrelin of Rats with Diarrhea of Asdthenic Splenonephro-yang

LI Xia1，LIU Fu-lin1，QING Long-li1，DENG Na1，LIN Xiao-yuan2，3*
(1.Hunan University of TCM，Changsha 410208，China;2.First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Changsha 410007，China; 3.State Key Laboratory Breeding Base for Hunan Provincial Chinese Medicine Powder and Innovative Drugs，Changsha 410208，China)

Objective:To observe the effect of Sishen pill on the gastrointestinal motility and Ghrelin of rats with diarrhea of Asdthenic Splenonephro-yang.Methods:72 SPF SD rats were randomly divided into Normal group，Mode group，Dicetel group，Sishen pill high dose-，medium dose-and low dose groups，with 12 rats in each group.Except the Normal group，other groups were treated with intragastric administration of adenine and Senna Water decoction to replicate model rats with diarrhea of Asdthenic Splenonephro-yang.After 14 days，the general state，diarrhea index，gastric motility and transit function of intestinal movement and serum Ghrelin levels were examined after administering intragastricly.Results:Rats in the Model group，although thegeneral state had improved，the diarrhea still persisted，and the residual rate of gastric，intestinal propulsion rate and serum Ghrelin levels were significantly different compared with those in the Normal group(P＜0.01).In each dose group of Sishen pill and Dicetel group the above indexes were improved compared with those in model group(P＜0.05 or P＜0.01).In Sishen pill high dose group the gastric remnant rate and intestinal propulsive rate were superior to those in other groups(P＜0.05).The serum Ghrelin content in Sishen pill high dose group was superior to that in medium and low dose groups(P＜0.05).But in Sishen pill medium and low dose groups the gastric residual rate and intestinal advance rate and the serum levels of Ghrelin content in the high and medium dose groups had no significant difference compared with those in Dicetel group(P＞0.05).Conclusion:Sishen pill can effectively alleviate the symptom of diarrhea rats with Asdthenic Splenonephroyang，and the effect of high dose group is the best.The mechanism of action may be related to the regulation of gastrointestinal motility and serum Ghrelin level.

Sishen pill;Diarrhea;Asdthenic Splenonephro-yang;Gastric emptying;Intestinal advance;Ghrelin

R28

A

1002-2406(2017)02-0055-04

國家自然科學基金青年項目(No.81403380);湖南省教育廳科研優秀青年項目(No.15B178)

李霞(1991-)，女，碩士研究生，主要研究方向:中醫藥防治胃腸疾病。

藺曉源*(1985-)，男，助理研究員，主要研究方向:中醫藥防治內科重大疾病。

2016-07-19

修回日期:2016-08-10