UPLC同時測定雙黃連粉針劑中黃芩苷、綠原酸、連翹苷成分的含量

張丹丹，馮程，顧媛媛，譚福柱，陳大忠*

(1.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

UPLC同時測定雙黃連粉針劑中黃芩苷、綠原酸、連翹苷成分的含量

張丹丹1，馮程1，顧媛媛1，譚福柱2，陳大忠1*

(1.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:建立超高效液相色譜法同時檢測雙黃連粉針劑中黃芩苷、連翹苷、綠原酸三種成分含量的測定方法。方法:采用Acquity UPLC TM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，乙腈-0.1%甲酸為流動相進行梯度洗脫，柱溫為40℃，流速為0.3 ml/min。結果:黃芩苷、連翹苷、綠原酸分別在1.021 6～10.216、0.611 8～6.118、0.402 4～4.024 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數分別為0.999 6、0.999 3、0.999 5，3種成分平均回收率均符合含量測定要求。結論:本法高速、準確、簡單易行，已成功用于實際樣品的分析，可為雙黃連粉針劑的質量控制提供參考方法。

雙黃連粉針劑;超高效液相色譜法;黃芩苷;連翹苷;綠原酸;含量測定

雙黃連粉針劑(凍干)是由黃芩、金銀花、連翹等中藥提取純化經噴霧干燥制成的粉針劑，具有清熱解毒，輕宣透邪的功效，在臨床上經常加入適當溶媒供靜脈注射使用，現已廣泛用于肺炎、扁桃體炎、上呼吸道感染、急性腎盂腎炎、急性膽囊炎、小兒腸炎、嬰幼兒肺炎、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒三型感染等多種疾病［1-2］。然而雙黃連粉針劑是個復雜組群，還有很多化合物存在同系物或同分異構體的形式，普通的分析方法不足以有效控制其質量。《中國藥典》通過3種獨立的HPLC-UV法分別測定雙黃連粉針劑中黃芩苷、連翹苷、綠原酸的含量，但連翹苷則必須需要經氧化柱等處理，整個過程很麻煩。制劑現行標準中規定了測定綠原酸、黃芩苷的含量，但是沒有連翹的含量指標顯示。想要測定的這兩種成分卻必須要采用不同的流動相系統分別進行檢測，實際操作也比較麻煩，工作效率較低。我們采用UPLC法進行梯度洗脫同時聯合多波長檢測同時對其中含量相對較高的三種成分進行含量測定，為高效控制和評價雙黃連粉針劑的質量提供有效的方法。

高效液相色譜法［3-5］具有易操作、靈敏度和穩定性高等特點，但存在溶劑用量大，耗時長等缺點。UPLC是近幾年推出的一種新的液相色譜技術，作為中藥成分分析中定性和定量的有力工具，具有分析速度和分辨率高，專屬性強，定性能力強等優點，較常規HPLC有了較大的提升，較好地分離效率、峰容量及靈敏度，顯著縮短分析時間并減少溶劑損耗，使其更適合于藥物復方制劑及復雜樣品的分析研究。

1 儀器與試藥

美國Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀(包括在線真空脫氣機、自動進樣器、四元梯度泵、二極管陣列檢測器和柱溫箱);MassLynx V4.1色譜工作站;JA-2003精密電子天平(上海市良平儀器廠); KH-300E型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

連翹苷對照品(批號110821-201213，供含量測定用)、黃芩苷對照品(批號110715-201314，供含量測定用)、綠原酸對照品(批號110753-201314，供含量測定用)均購自中國食品藥品檢定研究院;雙黃連粉針劑(哈藥集團中藥二廠，規格:600 mg/支，批號1409419、1409418、1409417、1409416、1409415、1409414、1409413、1409410、1409407、1409406);甲酸(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司);乙腈(色譜純，美國Fisher公司);水為屈臣氏蒸餾水;其他化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜 柱為 ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm);流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水，流速為0.3 mL/min;柱溫為40℃;進樣量:3 μL;進行梯度洗脫(見表1)。

2.2 溶液的制備

表1 梯度洗脫表

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取黃芩苷、連翹苷、綠原酸對照品適量，用50%的甲醇溶解定容于10 mL的棕色容量瓶中，制得對照品溶液(貯備溶液);精密量取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對照品，加入50%甲醇溶液分別制成每1 mL含綠原酸40 μg、連翹苷60 μg、黃芩苷100 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

從每批藥品中隨機取本品5支，混勻，量取本品50 mg，精密稱定，加入50%的甲醇溶液20 ml，置于25 mL的具塞錐形瓶中超聲處理20 min，補足重量，用50%的甲醇定容于 25 mL容量瓶中，搖勻，再過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.3 系統性試驗

在“2.1“項下色譜條件，黃芩苷，綠原酸，連翹苷的理論塔板數均大于2 500，各個指標的成分也分離的較好。色譜圖見圖1～2。

圖1 混合對照品溶液的UPLC色譜圖

圖2 供試品溶液的UPLC色譜圖

2.4 線性考察

分別精密量取上述混合對照品貯備溶液1、2、4、6、8、10 mL分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別進樣10 μL。記錄色譜圖，分別以峰面積(Y)作為縱坐標，對照品進樣量(X)為橫坐標，繪制標準曲線并計算相應的回歸方程，見表2。

表2 各組分線性回歸方程

2.5 精密度試驗

取同一批次供試品溶液(批號1409407)，按“2.1”項下色譜條件，“2.2.2”項下制備供試品溶液的方法，連續進樣6次，每次5 μL，記錄各峰面積，分別計算其RSD值，結果黃芩苷、連翹苷和綠原酸峰面積的RSD值分別為1.72%、2.02%、2.34%，表明儀器具有良好的精密度。

2.6 重復性試驗

取供試品雙黃連粉針劑(批號1409407)，精密稱定6份，每份約 20 mg，按“2.1”項下色譜條件，“2.2.2”項制備供試品溶液的方法，分別進樣5 μL，連續進樣6次，計算各成分含量，黃芩苷、連翹苷和綠原酸含量的RSD值分別為1.45%、1.98%、2.26%，表明該方法具有良好的的重復性。

2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液(批號1409407)，分別于0、2、4、6、8、12、24 h內進樣，按“2.1”項下色譜條件，“2.3”項制備供試品溶液的方法，分別進樣5 μL，記錄各峰面積，黃芩苷、連翹苷和綠原酸峰面積的RSD值分別為1.33%、1.81%、2.12%，表明該方法具有較好的穩定性。

2.8 回收率試驗

取雙黃連粉針劑(批號1409407)粉末10 mg，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，加入適量的對照品溶液，按“2.2.2”項下制備供試品溶液的方法，平行制備6份供試品溶液，每次進樣5 μL，計算回收率，見表3。

表3 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.9 樣品測定方法

分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL按“2.1”項下色譜條件，“2.2.2”項下制備供試品溶液的方法，注入超高效液相色譜儀進行檢測，根據色譜圖按外標兩點法計算其含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果(mg/支，n=3)

3 結果與討論

在通過比較洗脫效果及酸度影響的考察中，發現乙腈具有良好的洗脫效果，而且當甲酸的濃度為0.1%時色譜峰的峰型較滿意，故流動相選擇乙腈-0.1%甲酸進行試驗。在考察色譜條件時，選用了既能縮短分離時間，又能提高分離效果的梯度洗脫方法，進行試驗。在試驗中發現，由于水溶液的穩定性差，存在含量衰減的現象，在換用50%甲醇［6］時，發現衰減現象消失，置于室溫下，可放置72 h符合檢測的要求。在對溶劑的考察中，發現對50%的甲醇通過超聲處理和加熱回流處理的提取效果基本無差異，考慮節約時間等因素，所以采用了50%的甲醇超聲處理20 min。

本文建立了快速、簡便的方法，用超高效液相色譜同時測定雙黃連粉針劑中黃芩苷，綠原酸、連翹苷三種藥效成分含量，有機溶劑消耗較少，分析時間縮短為普通高效液相色譜的1/3，既減少了環境污染，又降低了成本。本法適用于雙黃連粉針劑三種成分的高效快速測定，可以為雙黃連的質量控制和藥物療效、化合物含量研究、藥代動力學等相關研究提供新的參考方法和科學依據。

［1］張潔，馬百平，趙陽，等.雙黃連粉針劑指紋圖譜中特征峰的組成藥味歸屬及定性［J］.中成藥，2005，27(12):1365-1369.

［2］曲敬來，高雪，陳生，等.雙黃連凍干粉劑鼻腔沖洗在上氣道咳嗽綜合征治療中的應用［J］.中醫藥學報，2015，43(6):79-81.

［3］趙麗芬，韓省力.高效液相色譜法測定雙黃連粉針劑中黃芩苷的含量［J］.中醫藥信息，2015，32(6):31-33.

［4］筆雪艷，王憲平，張清波，等.HPLC-UV-ELSD聯用法測定雙黃連系列制劑中連翹含量并同時檢查山銀花［J］.藥物分析雜志，2014，34(1):104-107.

［5］梁軍，楊琦，夏永剛，等.雙黃連口服液的HPLC指紋圖譜研究［J］.中醫藥學報，2013，41(6):24-25.

［6］孫永慧，李文春.HPLC同時測定雙黃連粉針劑中5種成分的含量［J］.中成藥，2010，32(1):65-68.

Simultaneous Determination of Baicalin，Chlorogenic Acid，Forsythin in Shuanghuanglian Powder Injection by UPLC

ZHANG Dan-dan1，FENG Cheng1，GU Yuan-yuan1，TAN Fu-zhu2，CHEN Da-zhong1*
(1.Research Institute of Chinese Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

Objective:To establish a rapid UPLC method for simultaneously determining baicalin，phillyrin，chlorogenic acid in Shuanghuanglian powder for injection.Methods:UPLC assay was carried out by using the Acquity UPLCTMBEH C18 column(2.1 mm×50 mm，1.7 μm).The mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid，solution for gradient elution.The column temperature was 40℃.The flow rate was 0.3 ml/min.Results:The linear ranges of baicalin，forsythin and chlorogenic acid in the range of 1.021 6～10.216，0.611 8～6.118，0.402 4～4.024 μg/mL respectively.The three components showed a good linear correlations(r=0.999 6，0.999 3，0.999 5).The average recoveries of three components are in line with the requirement of determination.Conclusion:The method is efficient，accurate and simple，and has been used for the analysis of real samples successfully，which can provide a reference for the quality control of Shuanghuanglian powder for injection.

Shuanghuanglian powder-injection;UPLC;Baicalin;Phillyrin;Chlorogenic acid;Content determination

R28

A

1002-2406(2017)02-0039-03

黑龍江省應用技術研究與開發計劃項目(No.GC13C109);“重大新藥創制”科技重大專項-雙黃連粉針劑技術改造(No.2011ZX09201-201-15)

張丹丹(1991-)，女，碩士，主要研究方向:中藥物質基礎成分研究和新藥研究。

陳大忠*(1970-)，男，研究員，碩士研究生導師，主要研究方向:中藥物質基礎成分研究和新藥研究。

2016-02-20

修回日期:2016-03-10