單增李斯特菌srtA基因敲除菌株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

李 森，熱依漢古麗·麥麥提力

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

單增李斯特菌srtA基因敲除菌株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

李 森，熱依漢古麗·麥麥提力

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌是常見的食源性致病菌，其細(xì)胞壁上存在的表面蛋白與其致病性和細(xì)菌菌膜的形成密切相關(guān)，而srtA基因是介導(dǎo)表面蛋白膜表面定位的關(guān)鍵因子，通過識別特定的蛋白序列將表面蛋白共價(jià)結(jié)合在細(xì)胞壁上，也是單增李斯特菌的重要毒力基因。為深入研究srtA的功能及其對細(xì)菌毒力的調(diào)控，本研究通過同源重組技術(shù)敲除了單增李斯特菌中的srtA基因，并對基因敲除菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。通過生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)srtA基因敲除株的生長活性低于野生型菌株。進(jìn)一步利用該菌株對星形膠質(zhì)細(xì)胞系U251的侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，srtA基因敲除菌株的侵襲效率低于野生菌株，提示srtA基因在調(diào)控單增李斯特菌的侵襲能力方面發(fā)揮重要作用。本研究可為單增李斯特菌毒力基因調(diào)控和細(xì)菌菌膜的研究提供理論依據(jù)。

單增李斯特菌；srtA基因；同源重組；生長曲線；侵襲

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特菌，是一種常見的人畜共患菌，由于其在環(huán)境中廣泛存在，也是食品行業(yè)中的常見污染菌[1]。單增李斯特菌易生成菌膜造成該菌難被清除。同時(shí)該菌具有較強(qiáng)的致病性，可以穿透人體的三大屏障——腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障，造成人體感染，嚴(yán)重可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)、死胎等，對人體健康的危害極大[2-3]。根據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，由該菌感染造成的死亡率高達(dá)30%～50%，因此被世界衛(wèi)生組織定義為四大食源性致病菌之一[4-5]。對該菌致病機(jī)理的研究將有助于預(yù)防和治療該菌引起的食源性疾病。目前已有許多研究表明細(xì)菌自身表達(dá)的一些表面蛋白在菌膜形成、細(xì)菌毒力的調(diào)控和對宿主細(xì)胞的侵襲方面發(fā)揮重要作用。例如表面蛋白InlA和InlB是參與細(xì)菌黏附和侵襲宿主細(xì)胞的重要因子[6-7]，而介導(dǎo)這些表面蛋白膜定位的是sortase家族的蛋白。

Sortase A（SrtA）是分選酶sortase家族的成員之一，最早由Mazmanian等[8]于1999年在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)。sortase是一組介導(dǎo)表面蛋白革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合的蛋白酶。根據(jù)識別序列的不同，sortase分為SrtA、SrtB、Srt C和SrtD 4 種[9]。SrtA識別含有LPXTG序列的表面蛋白，通過將蛋白C-末端的LPXTG進(jìn)行水解后，利用轉(zhuǎn)肽作用將表面蛋白錨定在細(xì)胞壁的表面[10]。研究發(fā)現(xiàn)，SrtA參與內(nèi)化素InlA蛋白的膜定位過程[11]。InlA是參與細(xì)菌侵襲過程的重要因子，在單增李斯特菌侵襲內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等過程中起到關(guān)鍵性作用[12]。由此可以推測，srtA基因可能對細(xì)菌的侵襲起到一定的調(diào)控作用。為了更好的研究srtA基因的功能，本研究利用同源重組的方法構(gòu)建了srtA基因敲除菌株，并對敲除株的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

單增李斯特菌株EGDe為上海理工大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。pKSV7質(zhì)粒由上海交通大學(xué)史賢明教授惠贈(zèng)。pMD-19T載體購自大連寶生物公司。U251細(xì)胞系購自上海細(xì)胞庫。

腦心浸出液（brain heat infusion，BHI）肉湯 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco’s modif i ed Eagle’s medium，DMEM） 美國Gibco公司；胎牛血清 上海博升生物科技有限公司；rTaq DNA聚合酶和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑、限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ、KpnⅠ和SalⅠ）、DNA Marker、T4連接酶 大連寶生物公司；質(zhì)粒抽提試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；氨芐青霉素、氯霉素及其他常規(guī)試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 引物

本實(shí)驗(yàn)中用到的引物均參照GenBank中公布的序列（ID：986837）設(shè)計(jì)，具體引物序列如表1所示。

表1 引物序列信息Table1 Primer sequences

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī) 德國Eppendorf公司；電穿孔儀 美國Bio-Rad公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 目的基因片段的制備

將EGDe接種于BHI培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜后收集菌體抽提細(xì)菌基因組。分別利用srtA 5’和srtA 3’引物擴(kuò)增srtA的上下游同源臂。將PCR片段回收后利用BamHⅠ對片段進(jìn)行單酶切。將單酶切產(chǎn)物分別回收后用T4 DNA連接酶連接，并進(jìn)一步連接pMD-19T載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)進(jìn)行菌落PCR鑒定。將陽性克隆送華大基因公司測序。

1.3.2 穿梭載體pKSV7-Δ srtA的構(gòu)建

將1.3.1節(jié)中測序正確的陽性菌株中的質(zhì)粒進(jìn)行抽提作為PCR模板，利用srtA 5’F和srtA 3’R引物進(jìn)行擴(kuò)增。將DNA片段回收后進(jìn)行KpnⅠ和SalⅠ的雙酶切，同時(shí)將穿梭載體pKSV7進(jìn)行相同的雙酶切反應(yīng)。分別回收酶切產(chǎn)物后，利用T4連接酶將srtA片段連入pKSV7載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行菌落PCR的鑒定及質(zhì)粒的酶切鑒定，將陽性克隆送華大基因公司測序。

1.3.3 目的基因片段與野生型菌株基因組的同源重組

將1.3.2節(jié)中測序正確的質(zhì)粒抽提后通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)入單增李斯特菌感受態(tài)細(xì)胞，并涂布氯霉素抗性（10 μg/mL）BHI板進(jìn)行克隆的篩選。將含有穿梭載體的單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基，在溫度（41 ℃）和氯霉素抗性（10 μg/mL）的雙重壓力下進(jìn)行同源重組。每12 h傳代一次，共傳8 代后將末代培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行氯霉素抗性（10 μg/mL）板劃線培養(yǎng)。挑取單克隆接種于新鮮BHI培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng)以丟失抗性質(zhì)粒，每12 h傳代一次，6 代后將末次培養(yǎng)物進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

1.3.4 srtA敲除菌株的鑒定

挑取1.3.3中平板上的單菌落進(jìn)行雙引物PCR鑒定，將srtA 5’F和srtA 3’R單一擴(kuò)增片段為1 400 bp，同時(shí)srtA koF和srtA koR無擴(kuò)增片段的菌落視為陽性克隆。將鑒定出的陽性克隆進(jìn)一步利用無抗性板和氯霉素抗性（10 μg/mL）板劃線培養(yǎng)，最終得到無抗性板上生長、抗性板上不生長且PCR鑒定正確的為srtA敲除菌株。

1.3.5 細(xì)菌生長曲線的測定

將野生型和ΔsrtA菌株平板劃線培養(yǎng)，分別挑取單克隆接種于BHI培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～14 h后，取部分菌液用新鮮培養(yǎng)基按100 倍稀釋，至OD600nm為0.14左右。置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，每2 h測定OD600nm，記錄細(xì)菌生長情況。

1.3.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將U251細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種到12 孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，并于侵襲實(shí)驗(yàn)開始前1 h換不含血清的DMEM培養(yǎng)。將EGDe和ΔsrtA菌株于BHI培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜，測定OD600nm，并利用新鮮BHI培養(yǎng)基將細(xì)菌的OD600nm調(diào)至0.3。將細(xì)菌按感染復(fù)數(shù)值100∶1的比例加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)1.5 h。小心移除細(xì)胞培養(yǎng)液后加入D-Hanks稀釋的慶大霉素（500 μg/mL）培養(yǎng)1 h，殺死細(xì)胞外的細(xì)菌。D-Hanks洗滌細(xì)胞3 次后加入1% TritonX-100裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液稀釋10 000倍后涂BHI平板培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)平板上生長的克隆數(shù)，計(jì)算細(xì)菌菌體濃度（以lg（CFU/mL）表示），比較不同細(xì)菌的侵襲效率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

文中折線圖和柱形圖利用GraphPad軟件繪制。srtA敲除菌株和野生型菌株的生長曲線數(shù)據(jù)分析采用雙因素方差分析（two-way analysis of variance，two-way ANOVA），srtA敲除菌株和野生型菌株的侵襲效率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用two-way ANOVA。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因片段的克隆

圖1 srtA基因敲除菌株構(gòu)建策略Fig.1 Construction strategy of srtA knockout strains

根據(jù)GenBank上公布的序列，設(shè)計(jì)srtA的敲除策略（圖1），設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增上游同源臂srtA 5’和下游同源臂srtA 3’的PCR產(chǎn)物分別為844 bp和600 bp（圖2A），BamHⅠ單酶切并連接到pMD-19T載體后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌涂平板培養(yǎng)，挑取平板上長出的4 個(gè)克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定，在1 400 bp處擴(kuò)增出陽性片段（圖2B），符合預(yù)期。

圖2 srtA上（A）、下（B）游片段的克隆Fig.2 Cloning of srtA up-stream and down-stream sequences

2.2 敲除載體的構(gòu)建

圖3 pKSV7-ΔsrtA載體的酶切鑒定Fig.3 Verif i cation of pKSV7-Δ srtA by double enzyme digestion

將pMD-19T-Δ srtA載體送公司測序后將測序正確的克隆作為模板，利用5’F和3’R引物進(jìn)行PCR，將得到的陽性片段進(jìn)行雙酶切后與穿梭載體pKSV7進(jìn)行連接得到pKSV7-ΔsrtA。利用PCR及雙酶切對平板上的克隆進(jìn)行鑒定。經(jīng)過雙酶切鑒定可以發(fā)現(xiàn)，挑取的6 個(gè)克隆均為陽性克隆，即酶切可以得到約1 400 bp左右的片段（圖3）。

2.3 重組同源菌的篩選

圖4 srtA基因敲除菌株的菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Identif i cation of srtA knockout strains by colony PCR

將得到的pKSV7-ΔsrtA載體通過電穿孔的方式轉(zhuǎn)入單增李斯特菌后，利用氯霉素抗性和溫度進(jìn)行篩選，將經(jīng)過多次傳代后得到的克隆進(jìn)行PCR雙引物鑒定。根據(jù)構(gòu)建的策略，如果用5’F和3’R引物進(jìn)行擴(kuò)增，野生型菌株得到2 200 bp左右的片段，而敲除菌株得到約1 400 bp大小的片段，雜合子菌株的同時(shí)具有1 400 bp和2 200 bp兩種片段，同時(shí)利用srtA ko引物進(jìn)行擴(kuò)增，野生型和雜合子菌株得到400 bp片段，敲除菌株則應(yīng)無片段擴(kuò)增。挑取的16 個(gè)克隆當(dāng)中只有9號和12號克隆符合上述條件，為疑似陽性克隆（圖4），利用氯霉素抗性對這兩個(gè)克隆進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，得到抗性板上無菌落生長的為陽性克隆，經(jīng)鑒定9號和12號克隆均為陽性克隆。

2.4 敲除菌株生長曲線

圖 5srtA敲除菌株與野生型菌株的生長曲線Fig.5 Growth curves of srtA knockout strain and wild-type strain

將野生型EGDe菌株和ΔsrtA菌株培養(yǎng)后，分別檢測兩者的生長曲線，結(jié)果顯示從培養(yǎng)4 h開始，敲除菌株的生長速率低于野生型菌株，過夜培養(yǎng)后OD600nm的差別更加明顯。兩種菌株均在12 h左右OD600nm達(dá)到最高，然后進(jìn)入衰亡期，增殖減慢，菌體大量死亡，OD600nm逐漸下降。當(dāng)培養(yǎng)液中大部分菌體死亡后，細(xì)菌增殖能力開始提高，此時(shí)OD600nm又開始回升。因此培養(yǎng)24 h OD600nm降至最低點(diǎn)后又有所升高（圖5），此時(shí)srtA敲除菌株的OD600nm還是低于野生型菌株。本結(jié)果顯示srtA的敲除對細(xì)菌本身的生長活力造成一定影響。

2.5 srtA敲除對單增李斯特菌侵襲的影響

作為分選酶家族成員，SrtA被證實(shí)與單增李斯特菌的內(nèi)化素的膜定位相關(guān)，而內(nèi)化素是細(xì)菌侵襲的關(guān)鍵因子。為了驗(yàn)證srtA敲除對細(xì)菌毒力的影響，本研究利用人膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251進(jìn)行了細(xì)菌的侵襲實(shí)驗(yàn)。利用慶大霉素將未侵襲的細(xì)菌殺死后，通過計(jì)算細(xì)胞內(nèi)侵襲細(xì)菌的菌體濃度檢測細(xì)菌的侵襲效率。如圖6所示，EGDe和ΔsrtA的lg（CFU/mL）分別為5.4和4.7左右，即敲除菌株的菌體濃度明顯低于野生型菌株（圖6），說明ΔsrtA的侵襲效率低于EGDe，因此證明srtA的敲除影響了細(xì)菌的侵襲能力。

圖6 srtA敲除菌株與野生型菌株EGDe的侵襲效率Fig.6 Invasion eff i ciencies of srtA knockout strain and wild-type strain

3 結(jié) 論

基因敲除是研究基因功能的重要生物學(xué)手段，而細(xì)菌自身結(jié)構(gòu)簡單易于操作、染色體復(fù)雜程度較低等特點(diǎn)也為基因敲除菌株的構(gòu)建提供了便利，因此被國內(nèi)外學(xué)者廣泛用于基因功能的研究、減毒疫苗的研發(fā)等領(lǐng)域。本研究利用同源重組成功構(gòu)建了srtA基因的基因敲除菌株并對其生物學(xué)特性做了初步分析。生長曲線的測定發(fā)現(xiàn)srtA基因的缺失使得細(xì)菌自身的生長增殖能力降低，說明srtA基因?qū)?xì)菌自身的生長能力有一定的調(diào)控作用。SrtA特異識別含有LPXTG序列的膜表面蛋白并將這類蛋白通過蛋白修飾定位到細(xì)胞壁上，srtA的缺失影響了這類蛋白的定位，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁成分的改變，從而會(huì)對細(xì)胞的生長增殖造成一定影響。但兩種菌種之間OD600nm的差異并不是非常大，也提示srtA基因并不是細(xì)菌生長增殖活動(dòng)最關(guān)鍵的調(diào)控因素或者有其他sortase家族的成員部分代償了srtA的功能。

單增李斯特菌是一種典型的胞內(nèi)寄生菌，通過黏附、內(nèi)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，并且在宿主細(xì)胞內(nèi)存活、增殖，進(jìn)而在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播擴(kuò)散，造成感染。黏附是細(xì)菌侵襲宿主細(xì)胞的第一步，也是細(xì)菌定植致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。細(xì)菌表面的內(nèi)化素是介導(dǎo)細(xì)菌黏附和內(nèi)化的重要毒力因子，而內(nèi)化素蛋白的膜表面定位則離不開分選酶的作用。經(jīng)研究證實(shí)內(nèi)化素InlA、InlJ的膜定位過程均由SrtA所介導(dǎo)[14]，與細(xì)菌侵襲哺乳動(dòng)物細(xì)胞相關(guān)的另一個(gè)膜表面蛋白Vip的膜定位也受到SrtA調(diào)控。另外，細(xì)菌菌毛是細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有研究證實(shí)一些革蘭氏陽性菌菌毛的形成需要SrtA的參與[15-16]，含有LPXTG序列的菌毛亞基蛋白前體分子由SrtA定位到菌毛上。由此可見，SrtA在調(diào)控細(xì)菌致病性方面起著重要的調(diào)控作用。Chen Fuguang等[17]在金黃色葡萄球菌中敲除srtA基因后發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌對宿主細(xì)胞的黏附率降低，并且宿主細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平下降。本研究利用星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞作為宿主細(xì)胞進(jìn)行的侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ΔsrtA菌株侵襲U251細(xì)胞的侵襲效率明顯低于野生型菌株，證實(shí)srtA在調(diào)控單增李斯特菌侵襲神經(jīng)細(xì)胞中起到重要的調(diào)控作用。

細(xì)菌菌膜是細(xì)菌對抗逆境的一種自我保護(hù)機(jī)制，一旦形成極難去除，極易造成食品生產(chǎn)線的污染，并且菌膜也是細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的重要因素，易造成病灶部位反復(fù)感染并發(fā)展為慢性炎癥[18]。菌膜是由一些細(xì)菌表面蛋白、胞外多糖等構(gòu)成的生物膜結(jié)構(gòu)，因此SrtA在調(diào)控細(xì)菌菌膜形成中也發(fā)揮重要作用。許多研究表明SrtA可以調(diào)控鏈球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的菌膜形成[19-21]。基于SrtA在調(diào)控細(xì)菌膜表面蛋白定位、細(xì)菌致病性、菌膜形成等過程中所起的重要作用，近年來SrtA被作為抑制細(xì)菌感染的重要靶標(biāo)，許多學(xué)者期望通過研發(fā)針對SrtA的抑制劑藥物達(dá)到抑制和消除細(xì)菌感染的目的[22]。作為胞內(nèi)寄生菌，單增李斯特菌能夠良好的誘發(fā)細(xì)胞免疫，是潛在的優(yōu)良疫苗載體[23]。本研究成功構(gòu)建了srtA敲除突變菌株，并發(fā)現(xiàn)其毒力降低，能夠?yàn)橹亟M活疫苗載體的研發(fā)提供一定理論與技術(shù)支持。

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Construction and Biological Properties of srtA Gene Knockout Mutant Strains of Listeria monocytogenes

LI Sen, Zejhanguri·MAMATIRI
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

Listeria monocytogenes is a common foodborne pathogen. Cell wall-anchored surface proteins are closely related to the pathogenicity and biofilm formation of the bacterium. The srtA gene is a key factor that mediates the membrane anchoring of surface proteins, and as an important virulence gene of L. monocytogenes it can covalently bind surface proteins to the cell wall by recognizing specif i c peptide sequences. For a better understanding of the function of srtA and its role in bacterial virulence regulation, we knocked out the srtA gene in L. monocytogenes by homologous recombination in this study, and evaluated the biological properties of the mutant strain. Based on its growth curve examination, we found that the growth rate of the mutant strain was slower than that of the wild-type one. Furthermore, the invasion eff i ciency of the mutant strain in glioma U251 cells was lower than that of the wild-type one. These results indicate that srtA may play an important role in regulating the invasiveness of L. monocytogenes, which will provide a theoretical basis for further understanding of the regulatory mechanisms of virulence genes in L. monocytogenes and biof i lm formation.

Listeria monocytogenes; srtA gene; homologous recombination; growth curve; invasion

10.7506/spkx1002-6630-201704019

TS201.3

A

1002-6630（2017）04-0113-05

李森, 熱依漢古麗·麥麥提力. 單增李斯特菌srtA基因敲除菌株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 113-117. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704019. http://www.spkx.net.cn

LI Sen, Zejhanguri·MAMATIRI. Construction and biological properties of srtA gene knockout mutant strains of Listeria monocytogenes[J]. Food Science, 2017, 38(4): 113-117. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704019. http://www.spkx.net.cn

2016-04-07

上海理工大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（1000308001）；上海市高校青年教師資助計(jì)劃項(xiàng)目（10-15-308-802）

李森（1982—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c營養(yǎng)。E-mail：lisen_1027@126.com