基于16S rDNA的醋酸菌篩選及其發酵特性

姚洪禮，李興江,2，鄭 志,2，宋 山，姜紹通,2，李 順，鄧永東，潘麗軍,2，吳學鳳,2,*

（1.合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

基于16S rDNA的醋酸菌篩選及其發酵特性

姚洪禮1，李興江1,2，鄭 志1,2，宋 山1，姜紹通1,2，李 順1，鄧永東1，潘麗軍1,2，吳學鳳1,2,*

（1.合肥工業大學食品科學與工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

醋酸菌是影響純種液態釀醋效率的關鍵因素。為獲得高質量濃度醋酸生產菌，本研究將常規篩選方法與分子生物學技術相結合進行優良醋酸菌的篩選。采用高質量濃度酒精和醋酸培養基富集，挑取醋酸菌膜初步分離目的菌；借助生理生化特征與16S rDNA保守序列分析方法鑒定并獲得一株產酸高的巴氏醋酸桿菌JST-S（Acetobacter pasteurianus JST-S，BJST-S）；在與滬釀1.01（Acetobacter pasteurianus HN 1.01）進行發酵特性對比研究時發現，BJST-S在生長速率、產酸速率及耐醇和耐酸等方面均優于滬釀1.01；半連續發酵3 批次BJST-S的產酸量維持在58.10～59.68 g/L，發酵強度維持在1.21～1.24 g/（L·h），說明該菌產酸特性穩定。研究結果可為醋酸工業化生產以及優良菌株的選育提供一定的理論參考。

巴氏醋酸桿菌；菌膜；16S rDNA；半連續發酵

醋是我國傳統發酵釀造的調味品之一[1]，食醋釀造大多是以醋酸菌為主的多種菌混合發酵。目前純種液態發酵釀醋已成為大規模工業化生產的趨勢，菌種是影響釀醋品質的重要因素之一，耐醇、耐酸醋酸菌的選育已成為該領域的研究熱點。由于醋醅[2]是多種菌（醋酸桿菌屬、葡萄糖醋桿菌屬、腸桿菌屬和乳酸桿菌屬）的混合體[3]，用單純的產酸為主的分離方法很難分離醋酸菌。此外，醋酸桿菌各種屬[4]（醋酸桿菌屬、葡萄糖醋桿菌屬、腸桿菌屬和乳酸桿菌屬）之間細胞形態和生理生化特征區別不明顯，因此采用菌體形態觀察和生理特性鑒定方法不夠準確。

微生物染色體上編碼16S rRNA相對應基因組DNA上的一段基因序列稱為16S rDNA[5-7]。16S rDNA可以作為細菌群落結構分析最常用的系統進化標記分子[8]。隨著分子分類理論和方法的日趨成熟，16S rDNA已經廣泛應用于系統發生學和菌種鑒定研究[9-10]。在醋酸菌的選育與同源性鑒定方面[11-14]也有一定的應用。

本研究根據巴氏醋酸桿菌形成菌膜的特性，將生理生化特征鑒定與16S rDNA保守序列分析方法相結合，試圖獲得一株耐酸、耐醇、產酸高的醋酸菌，并將其與滬釀1.01（Acetobacter pasteurianus HN 1.01）進行發酵特性對比分析，以評價篩選菌的產酸能力，擬為工業化醋酸生產和優良菌株的選取提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

醋醅購自煙臺帝伯仕自釀機有限公司；滬釀1.01、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌購于中國工業微生物菌種保藏管理中心，保藏于合肥工業大學農產品加工研究院實驗室。

1.1.2 培養基

種子培養基（YG1）：葡萄糖10 g/L、酵母膏5 g/L、MgSO41.1 g/L、K2HPO43.3 g/L，于0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min，取出冷卻，在無菌操作臺接種，并加入2%（體積分數，下同）無水乙醇。

發酵培養基（YG2）：葡萄糖10 g/L、酵母膏5 g/L、MgSO41.1 g/L、K2HPO43.3 g/L，于0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min，取出冷卻，接種前根據具體情況加入無水乙醇。

斜面、平板培養基（YG3）：酵母提取物10 g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂20 g/L，pH 4.5，于0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min，使用前加3%無水乙醇，擺成斜面制成斜面保存培養基。

YPG培養基：酵母提取物5 g/L、蛋白胨2 g/L、葡萄糖3 g/L。

分離培養基：酵母提取物10 g/L、葡萄糖10 g/L、碳酸鈣10 g/L、瓊脂20 g/L，pH 4.5，于0.1 MPa、121℃條件下蒸汽滅菌20 min，使用前加3%無水乙醇分裝無菌培養皿，制成碳酸鈣平板分離培養基。

淀粉瓊脂平板、乙醇利用培養基、甘油利用培養基均參考文獻[15]配制。

1.1.3 試劑

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，S D S）、蛋白酶K、Tr i s-H C l、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 上海生物工程科技服務有限公司；苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V） 北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；無水乙醇、Triton X-100、Dupanol溶液、Mcllvaine緩沖液 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫振蕩培養箱 上海品頓實驗設備公司；721紫外-可見分光光度計 江蘇天瑞儀器股份有限公司；酒精計 衢州艾普計量儀器有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵醋醅中菌體富集

稱取固體醋醅樣品2 g于50 mL pH 4的YG2中，32 ℃、150 r/min振蕩培養1 d。取1/3培養液接種在含6%無水乙醇和4%乙酸的50 mL的YG2（pH 4）中，32 ℃、150 r/min振蕩培養1 d。如此循環重復6 d，獲得初篩醋酸菌富集培養液。

1.3.2 醋酸菌分離

初篩的富集培養液于32 ℃靜置培養3 d，表面會形成一層菌膜，用接種環在培養基溶液表面輕輕挑取菌膜，涂布在分離培養基上，32 ℃培養48 h，挑取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的單菌落，于YG3中劃線保存[16]。

1.3.3 醋酸菌理化性質鑒定

采用在YPG上培養36 h后的醋酸產生菌及對照菌滬釀1.01進行生理生化反應，具體鑒定方法和依據參照《伯杰細菌鑒定冊》[17]。

1.3.4 醋酸菌的16S rDNA鑒定

醋酸菌基因組DNA的提取參照文獻[18-20]。目的菌株的16S rDNA基因擴增參照文獻[21-22]，引物序列為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1942R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

以篩選菌株基因組為模板，克隆得到目的基因。通過寶生物試劑盒對PCR擴增產物進行純化收集，經膠回收試劑盒純化后的16S rDNA基因送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，用DNAStar軟件將測序結果進行拼接，提交到NCBI與GenBank數據庫中收錄的菌株16S rDNA進行BLAST對比[23]。下載與待檢菌株同源性較高的典型醋酸菌的16S rDNA核苷酸序列，用MEGA 2.5軟件采用鄰位相連法（neighbor-joining）構建系統進化樹，根據基本的進化樹拓撲結構，采用1 000次Bootstrap抽樣對待檢菌株的分類進化地位進行分析評價[24]。

1.3.5 培養與發酵

1.3.5.1 種子培養

將BJST-S和滬釀1.01接取1 環于50 mL YG1中，30 ℃條件下170 r/min培養，每隔6 h取樣檢測生物量。

1.3.5.2 醋酸發酵

接種BJST-S和滬釀1.01種子液按體積分數2%接種于YG2中，30 ℃、170 r/min培養，每隔6 h取樣檢測指標。

1.3.5.3 半連續發酵

醋酸發酵達到48 h時將發酵液全部取出，無菌條件下8 000×g離心10 min，將收集的菌體全部接入滅菌后含6%無水乙醇的YG3中，繼續按上述條件發酵，如此循環操作，實現半連續發酵。每隔6 h取樣檢測指標。

1.3.6 指標測定

生物量的測定參照文獻[25]；產酸量的測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》指示劑法；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）活力的測定參考文獻[26-27]及Wood氏法[28]；乙醇質量濃度的測定參照文獻[29]。

2 結果與分析

2.1 醋酸菌的篩選與鑒定

2.1.1 理化性質的鑒定

按照1.3.1、1.3.2節菌株富集培養和分離的方法，將產生的菌膜涂布于分離培養基中培養，選取透明圈較大的優勢單菌落保存，分別編號為1～10，并進行淀粉水解實驗、乙醇利用實驗、甘油利用實驗、革蘭氏染色實驗及產酸定性實驗，結果如表1所示。

表1 醋酸菌理化性質鑒定結果Table1 Physiological and biochemical characteristics of acetic acid bacterial isolates

依據《伯杰細菌鑒定手冊》[17]與《常見細菌系統鑒定手冊》[30]進行菌株生理生化特征鑒定，3號菌株能夠利用乙醇和甘油，革蘭氏染色為陰性且能夠產酸，如表1所示，結合巴氏醋酸桿菌產生菌膜的特性可以初步確定3號菌株是巴氏醋酸桿菌。

2.1.2 16S rDNA的鑒定

2.1.2.1 基因片段提取和PCR擴增結果

圖1 3號醋酸菌的16S rDNA擴增基因片段Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR-amplif i ed 16S rDNA gene fragments from acetic acid bacterial strain No. 3

對篩選菌株16S rDNA擴增結果進行凝膠電泳檢測，如圖1所示，16S rDNA泳道顯示擴增基因大小在1 500 bp左右，結合相關參考文獻[31-32]可知，該基因片段符合實驗預計結果。

2.1.2.2 核苷酸序列分析

圖2 3號醋酸菌的16S rDNA核苷酸序列Fig.2 16S rDNA Nucleotide sequences of acetic acid bacterial strain No. 3

經過篩選和鑒定的3號菌株的16S rDNA序列（圖2）上傳到NCBI數據庫中，對比結果如表2所示，發現3號菌株的16S rDNA序列與Acetobacter屬中編碼為IFO 3283-01的Acetobacter pasteurianus IFO 3283-01的16S rDNA序列有很高的相似度，達到97%。Weisburg等[21]研究表明：16S rDNA可變序列的相似度超過97%即為同一屬，達到99%即為同一種。因此可以確定篩選所得菌株為巴氏醋酸桿菌。

表2 3號醋酸菌的16S rDNA與NCBI的對比結果Table2 Results of 16S rDNA sequence alignment of acetic acid bacterial strain No. 3

2.1.2.3 系統進化樹

圖3 基于16S rDNA序列采用NJ法構建的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences constructed by the neighbor-joining method

如圖3所示，由系統進化樹顯示所篩選的3號菌株與Acetobacter pasteurianus IFO 3283-01菌株處于同一分支，經過多次測試分析支持該分支；在NCBI數據庫中，與從傳統日本米醋發酵表面分離出的參考菌株Acetobacter pasteurianus IFO 3283-01有很高的相似度。綜合菌落形態學特征、生理生化特征實驗結果、16S rDNA序列同源性比較及系統進化樹分析結果，鑒定篩選的3號菌株為醋酸桿菌屬（Acetobacter），將該菌命名為巴氏醋酸桿菌JST-S（Acetobacter pasteurianus JST-S，BJST-S）。

2.2 BJST-S和滬釀1.01的發酵特性對比

2.2.1 BJST-S和滬釀1.01生長曲線

圖4 BJST-S和滬釀1.01的生長曲線Fig.4 Growth curves of BJST-S and HN 1.01

由圖4可知，BJST-S和滬釀1.01的生長曲線相似，在0～36 h為對數生長期，但是BJST-S菌種的OD600nm增長速率大于菌種滬釀1.01，說明在相同時間內BJST-S菌種生長速率高于滬釀1.01。36 h后則進入生長穩定期，且最終BJST-S菌種的OD600nm明顯高于菌種滬釀1.01。處于對數生長期的菌種活性最高，對外界因素敏感，此時接種可使菌體活性最高，因此選取種子培養時間為24 h。

2.2.2 不同無水乙醇用量BJST-S和滬釀1.01產酸對比

圖5 不同無水乙醇用量條件下滬釀1.01（A）和BJST-S（B）產酸對比Fig.5 Acid production of HN 1.01 (A) and BJST-S (B) at different initial alcohol concentrations

由圖5可知，無水乙醇用量從0%增加到6%，滬釀1.01和BJST-S產酸量都有明顯增加，且在6%乙醇體積分數時測得發酵液產酸量最高，滬釀1.01最高產酸量達到50.80 g/L，BJST-S的最高產酸量達到了53.88 g/L。當底物無水乙醇用量增加至8%時，測得發酵液中總酸量下降且二者差異明顯，BJST-S的產酸達到24.57 g/L，而滬釀1.01只有15.04 g/L。這是由于酒精有抑制細菌生長的作用，在發酵初期，無水乙醇用量過高反而會抑制醋酸菌的繁殖代謝，使產酸量增長變緩甚至下降。通過比較可知，BJST-S對乙醇耐受性要高于滬釀1.01，而在最優無水乙醇用量條件下，BJST-S的產酸能力略高于滬釀1.01的產酸能力。

2.2.3 不同接種量BJST-S和滬釀1.01產酸對比

圖6 不同接種量條件下滬釀1.01（A）和BJST-S（B）產酸對比Fig.6 Acid production of HN 1.01 (A) and BJST-S (B) under different inoculums sizes

采用6%無水乙醇的YG2培養基進行不同接種量BJST-S和滬釀1.01產酸對比研究，結果如圖6所示。由圖6可知，在所選接種量區間中，兩種醋酸菌的產酸量均隨接種量的升高有緩慢增加。當接種量為2%時，兩者產酸量均在84 h達到峰值；接種量為10%時，滬釀1.01在48 h接近峰值，而BJST-S在60 h達到峰值，且測得滬釀1.01總酸為53.74 g/L，BJST-S總酸57.48 g/L。這是因為當接種量較少時，乙醇對菌種的生長起到一定的抑制作用，使得菌種生長和產酸速率緩慢，峰值出現遲緩；當接種量為10%時，環境含氧量為抑制菌體生長的主要影響因素，呼吸強度較高的BJST-S對環境含氧量較敏感，三角瓶中氧含量不足時，更不利于菌種BJST-S生長繁殖和代謝，導致BJST-S最高產酸量峰值遲于滬釀1.01。通過比較可知，在最優接種量條件下，BJST-S的產酸量高于滬釀1.01，滬釀1.01最高產酸量為53.74 g/L，BJST-S最高產酸量為57.48 g/L。

2.2.4 不同初始醋酸含量BJST-S和滬釀1.01產酸對比

圖7 不同初始醋酸含量下的滬釀1.01（A）和BJST-S（B）產酸對比Fig.7 Acid production of HN 1.01 (A) and BJST-S (B) under different initial acetic acid concentrations

分別向含6%無水乙醇的YG2培養基中接入10%種子培養液，進行不同初始醋酸含量BJST-S和滬釀1.01產酸對比研究結果如圖7所示。由圖7可知，初始醋酸含量從1.0 g/L增加到8.2 g/L的過程中，滬釀1.01的產酸速率和產酸量升高，當初始醋酸含量超過4.6 g/L時產酸速率和產酸量則有所下降；而BJST-S在初始醋酸含量從1.0 g/L增加到6.4 g/L的過程中產酸速率和產酸量升高，在6.4 g/L初始醋酸含量總酸含量最大；滬釀1.01的最大總酸含量為61.04 g/L，BJST-S的最大總酸含量為64.09 g/L；當初始醋酸含量超過6.4 g/L時產酸速率和總酸含量則有所下降。說明BJST-S和滬釀1.01在過酸、堿性環境下不宜生長繁殖和代謝，且機體中的大多數反應與酶有關，過酸、過堿都會導致酶活力降低，從而導致產酸速率和產酸量下降；同時，也說明了在相同發酵條件下BJST-S的生長繁殖和代謝速率快且對乙酸的耐受力強。

2.2.5 BJST-S、滬釀1.01的ADH和ALDH活力對比

圖8 BJST-S和滬釀1.01的ADH/ALDH活性對比Fig.8 ADH/ALDH activities of BJST-S and HN 1.01

由圖8可知，2 種菌種的ADH和ALDH活力存在差異性，但在不同無水乙醇用量條件下的變化趨勢一致。在無乙醇情況下，2 種菌種的ADH和ALDH活力較低。無水乙醇用量在2%～4%間，隨著培養基中無水乙醇用量的升高，ADH和ALDH活力也提高，并在4%時兩種菌株酶活力達到最高，且滬釀1.01和BJST-S的ADH活力分別為3.50、3.72 U/mg，ALDH活力分別為2.25、2.48 U/mg，且BJST-S的ADH及ALDH活力明顯高于滬釀1.01。當無水乙醇用量在4%～8%間，2 種菌種的ADH及ALDH活性水平均下降。這與上述菌體的生長代謝一致，在低無水乙醇用量條件下，菌體產酸速率相對較快，表現為最先達到最高產酸量峰值；但在高用量無水乙醇脅迫下，菌種需要一定的時間適應生長環境，而導致產酸速率相對較慢，表現為延遲發酵周期。

2.2.6 BJST-S半連續發酵穩定性

圖9 BJST-S的批次搖瓶發酵過程中的變化曲線Fig.9 Time-course curves of batch fermentation of BJST-S in shaking fl asks

由圖9可知，發酵在0～36 h階段，產酸量呈線性上升，乙醇質量濃度降低；48 h時產酸量最大，為58.10 g/L，此時產酸強度為1.21 g/（L·h）；第2批次發酵48 h，最大產酸量為58.60 g/L，此時產酸強度為1.22 g/（L·h）；第3批次發酵48 h，最大產酸量為59.68 g/L，此時產酸強度為1.24 g/（L·h）。在半連續發酵3 批次中，BJST-S產酸量維持在58.10～59.68 g/L，發酵強度維持在1.21～1.24 g/（L·h），半連續發酵過程中產酸量和產酸強度變化趨勢基本一致，說明BJST-S產酸穩定性良好。

3 結 論

本研究利用醋酸發酵過程中巴氏醋桿菌形成菌膜的特性，對醋醅中混合菌進行初步分離，采用生理生化特征與16S rDNA保守序列分析相結合的方法對分離出的醋酸產生菌進行鑒定，獲得了BJST-S菌株；在與滬釀1.01進行發酵特性對比研究中，BJST-S菌株具有良好的生長特性和發酵產酸能力，且耐醇及耐酸特性優于滬釀1.01；在3批次半連續發酵中，BJST-S產酸量維持在58.10～59.68 g/L，發酵強度維持在1.21～1.24 g/（L·h），說明該菌產酸特性穩定，可進一步進行菌種選育，為純種液態釀造食醋的工業化生產提供依據。

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Screening and Fermentation Characteristics of an Acetic Acid Bacterial Strain Based on 16S rDNA for Vinegar Production

YAO Hongli1, LI Xingjiang1,2, ZHENG Zhi1,2, SONG Shan1, JIANG Shaotong1,2, LI Shun1, DENG Yongdong1, PAN Lijun1,2, WU Xuefeng1,2,*
(1. School of Food Science and Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, Hefei 230009, China)

Acetic acid bacteria are an important factor that inf l uences the eff i ciency of vinegar production by pure culture liquid-state fermentation. The goal of this study was to obtain an outstanding acetic acid bacterial strain for vinegar production by routine screening combined with molecular biological techniques. The target strain was isolated from the biof i lm formed in enrichment culture in the presence of high concentrations of alcohol and acetic acid. It was identif i ed as Acetobacter pasteurianus JST-S (BJST-S) based on physiological and biochemical characteristics combined with 16S rDNA sequence analysis. Comparative analysis of fermentation characteristics indicated that the BJST-S was better than Acetobacter pasteurianus CICC 20001 in term of growth rate, acid production rate, alcohol resistance and acid resistance. The concentration of acetic acid was maintained in the range of 58.10–59.68 g/L and the fermentation strength in the range of 1.21–1.24 g/(L·h) in three batches of semi-continuous fermentation, implicating that the fermentation characteristics of BJST-S were stable. Our fi ndings in this work may provide a valuable reference for strain breeding for the improvement of industrial vinegar production.

Acetobacter pasteurianus; bacterial biof i lm; 16S rDNA; semi-continuous fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201704002

TS255.1

A

1002-6630（2017）04-0006-07

姚洪禮, 李興江, 鄭志, 等. 基于16S rDNA的醋酸菌篩選及其發酵特性[J]. 食品科學, 2017, 38(4): 6-12. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201704002. http://www.spkx.net.cn

YAO Hongli, LI Xingjiang, ZHENG Zhi, et al. Screening and fermentation characteristics of an acetic acid bacterial strain based on 16S rDNA for vinegar production[J]. Food Science, 2017, 38(4): 6-12. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704002. http://www.spkx.net.cn

2016-06-28

國家自然科學基金青年科學基金項目（31601465）；安徽省自然科學基金面上項目（1408085MKL17）；安徽省科技重大專項（15CZZ03100）；合肥工業大學青年創新項目（JZ2014HGQC0124）

姚洪禮（1992—），男，碩士，研究方向為食品微生物。E-mail：yaohongli-@hotmail.com

*通信作者：吳學鳳（1981—），女，副教授，博士，研究方向為食品發酵工程。E-mail：applewuxf@hotmail.com