纈草醛對腸易激綜合征模型大鼠結腸CRF，TPH1 mRNA及5—HT表達的影響

陶絲雨+肖叢瑞+王晶+張淑靜+高譽珊+穆芳園+王一程+閆興麗

[摘要]該研究旨在通過探討蜘蛛香環烯醚萜類成分纈草醛對腸易激綜合征（IBS）大鼠結腸中促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）、色氨酸羥化酶1（TPH1） mRNA表達及5羥色胺（5HT）含量的影響，闡釋纈草醛通過5HT通路治療IBS的作用機制。將54只SD 雄性大鼠隨機分為空白對照組、模型組、纈草醛高、中、低劑量組、匹維溴銨組，每組9只。采用孤養結合慢急性不可預見性應激法建立IBS大鼠模型，免疫組化法測定大鼠結腸CRF表達，RTPCR法測定結腸中TPH1 mRNA表達，高效液相色譜法測定大鼠結腸中5HT含量。實驗結果顯示，孤養結合慢急性不可預見性應激可造成大鼠結腸中CRF，TPH1 mRNA表達以及5HT含量升高（P<005），纈草醛各劑量組中CRF，TPH1 mRNA及5HT含量較模型組明顯下降（P<005）。實驗結果表明，腸易激綜合征能夠導致結腸中CRF，TPH1 mRNA的表達以及5HT的含量升高，而纈草醛通過降低結腸中CRF，TPH1 mRNA的表達以及5HT的含量，而改善胃腸道的相關癥狀。

[關鍵詞]纈草醛； 腸易激綜合征； 促腎上腺皮質激素釋放因子； 色氨酸羥化酶1； 5羥色胺

Effects of baldrinal of Valeriana jatamansi on expression of CRF，

TPH1 mRNA and 5HT in rats with irritable bowel syndrome

TAO Siyu 1， XIAO Congrui 2， WANG Jing 2， ZHANG Shujing1， GAO Yushan1，

MU Fangyuan1， WANG Yicheng1， YAN Xingli1*

（1. School of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract]This study aimed to investigate the effects of baldrinal of Valeriana jatamansi on the expression of corticotropin releasing factor （CRF） and tryptophan hydroxylase 1 （TPH1） mRNA and levels of 5hydroxytryptamine （5HT） in colon of rats with irritable bowel syndrome （IBS）， and to explain its therapeutic mechanism on IBS through 5HT pathway Fiftyfour male SD rats were randomly divided into 6 groups： blank group， model group， baldrinal high， medium and low dose groups， and pinaverium bromide group， n=9 in each group The IBS rat models were established by using unpredictable chronic stress for 3 weeks followed by 1hour acute restraint stress （CAS） after 7 days of rest and independent feeding CRF expression was detected by IHCP； TPH1 mRNA expression was detected by using RTPCR and the 5HT level was measured by high performance liquid chromatography（HPLC） The results indicated that the method of chronic stress with acute restrain stress method and independent feeding could lead to the increase in expressions of CRF and TPH1 mRNA and levels of 5HT in IBS rats（P<005） The expressions of CRF， TPH1 mRNA and 5HT in baldrinal groups were significantly lower than those in model group（P<005） The experimental results showed that IBS could result in increase in the expressions of CRF， TPH1 mRNA and levels of 5HT， and the baldrinal of V jatamansi could improve the symptoms of IBS by reducing the expressions of CRF， TPH1 mRNA and levels of 5HT in colon of rats

[Key words]baldrinal； IBS； CRF； TPH1； 5HT

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS） 是一種臨床常見的胃腸功能紊亂性疾病，以腹痛、腹瀉、排便習慣和排便性狀異常為主要癥狀，持續存在或間歇發作，而無形態學和生化異常改變的癥候群[1]。IBS發病機制尚未完全明確，目前普遍認為內臟敏感性和腸道動力異常是IBS特征性的病理生理學基礎[2]。5羥色胺（5HT）含量的改變與IBS患者腹痛、腹瀉及內臟敏感等癥狀密切相關。

蜘蛛香Valeriano jatamansi Jones為敗醬科纈草屬植物，常用于治療脘腹脹痛，消化不良，腹瀉等疾病。課題組前期研究發現，蜘蛛香原粉[3]以及蜘蛛香環烯醚萜類成分11ethoxyviburtinal具有止瀉作用，并且可以通過降低結腸中5HT含量，改善IBS 模型大鼠的腸道功能紊亂[45]；同時降低結腸中P物質、血管活性肽和生長抑制素等胃腸激素的分泌水平[6]，抑制結腸嗜鉻細胞（EC）和肥大細胞（MC）的表達[7]，降低內臟敏感性，緩解IBS模型大鼠的癥狀。本實驗通過研究蜘蛛香另一環烯醚萜類成分纈草醛（baldrinal）對IBS模型大鼠結腸中與5HT合成相關的促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）及色氨酸羥化酶1（TPH1）的表達水平及5HT含量的影響，闡釋纈草醛治療IBS的作用機制。

1材料

11動物SD大鼠，體重120～140 g，雄性。北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）20150001。動物于20～24 ℃，濕度60%～70%，12 h明暗的環境中適應性飼養3 d后開始實驗。

12試劑免疫組化超敏SP試劑盒（兔、KIT9706）、DAB顯色試劑盒（DAB0031）：福建邁新生物技術開發有限公司；AntiCorticotropin Releasing Factor antibody（ab8901）：美國Abcam公司。Trizol（98903）：ambion；三氯甲烷（20120704）、異丙醇（20140417）：北京化工廠；反轉錄cDNA試劑盒（00322404）、Power SYBR Green PCR Master Mix（1511510）：Thermo Scientific。5HT（028K1582）：SIGMA；檸檬酸（051024）、乙二胺四乙酸二鈉（990730）：北京化學試劑公司；高氯酸（SHBG2241V）：SIGMAALDRICH。

13儀器1510型石蠟薄片切片機（德國LETIZ公司）；顯微鏡及分析系統（日本尼康公司）；液相色譜儀（Waters e2695）；電化學檢測器（Waters 2465）；C18柱（Waters，21 mm×150 mm，3 μm，Lot No：0159341691）；實時熒光定量PCR系統（Applied BiosystemsTM）；溫度梯度PCR儀（美國伯樂BioRad）；UV2600（A）紫外可見分光光度計（尤尼柯）。

14藥物蜘蛛香環烯醚萜類成分纈草醛：取適量纈草醛（纈草醛從蜘蛛香藥材中提取分離得到，由北京中醫藥大學中藥化學系提供），用蒸餾水配制成所需劑量的混懸液。纈草醛高、中、低劑量分別為06，03，015 mg·kg-1。其中纈草醛中劑量相當于人臨床等效量[8]。陽性藥物：得舒特（匹維溴銨片）：Abbott Products SAS，批號637753。用蒸餾水配制成所需劑量的混懸液，灌胃給藥量為25 mg·kg-1。給藥劑量相當于人臨床等效量（為人用劑量的7 倍）[9]。

2方法

21腸易激綜合征大鼠模型的制備及給藥SD雄性大鼠54只，按照隨機分組原則分為空白對照組、IBS模型組、纈草醛高、中、低劑量組、匹維溴銨組，每組9只。空白對照組不加任何刺激。其余各組的大鼠每籠1只孤養，60 d內隨機循環接收7種不同慢性刺激：①斷水（24 h）；②斷食（24 h）；③晝夜顛倒；④冷水刺激（4 ℃，5 min）；⑤潮濕飼養（24 h）；⑥夾尾致痛（1 min）；⑦束縛制動（5 h）。同時每30 d對大鼠進行急性束縛刺激1 h。各給藥組自實驗第33天開始灌胃給藥，給藥時間：每日上午9時，給藥體積為10 mL·kg-1，空白對照組與模型組給予同容量的蒸餾水，總計治療30 d[10]。

22免疫組化法測定結腸中CRF的表達治療結束后，給予10%水合氯醛麻醉后開胸，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注，取肛門上方7cm處結腸，放入4%多聚甲醛固定3 d，脫水、包埋、制蠟塊，切片制片后進行免疫組化。

切片常規脫蠟脫水后，PBS沖洗3次（每次3 min）；檸檬酸修復煮沸10 min；冷卻至室溫后PBS沖洗3次（每次3 min）；H2O2室溫封閉10 min；PBS沖洗3次（每次3 min）；滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min，甩去多余液體；滴加一抗80 μL，4 ℃過夜；次日PBS沖洗3次（每次5 min）；滴加生物素化二抗，室溫10 min；PBS沖洗3次（每次3 min）；滴加生物素化三抗，室溫10 min；PBS沖洗3次（每次3 min）；DAB試劑盒顯色劑顯色，室溫10 min（避光）；自來水沖洗3次（每次3 min）；常規脫水脫蠟后中性樹膠封片。顯微鏡觀察，記錄總積分光密度值（integrated option density，IOD）。

23熒光定量PCR測定結腸中TPH1 mRNA表達[11]治療結束后，大鼠斷頭處死，在低溫環境中迅速取截取距動物肛門5 cm處結腸1 cm，約100 mg，投入液氮中速凍后于-80 ℃保存。根據GenBank中登錄的TPH1和內參βactin基因序列設計引物（由上海英濰捷基公司合成）。TPH1的上游引物為5′GATGGTCAGTCTGGATGCTATG3′，TPH1的下游引物為5′GTCTCCTTGAAGTCTAGTGTGTG3′；βactin上游引物序列為5′ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT3′，βactin下游引物序列為5′CCAGAGGCATACAGGGACAA3′。使用Trizol提取結腸組織中總RNA，并以其為模板反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板PCR擴增TPH1基因。以2 μL cDNA作為模板進行熒光定量PCR擴增。反應條件為：95 ℃預變性10 min。以后95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環；融解曲線：PCR結束后，95 ℃，15 s，冷卻至60 ℃，1 min；60～95 ℃，每升高03 ℃，收集1次熒光信號，最后95 ℃，15 s。

相對表達量（relative qualification，RQ）=2（Ct對照目的基因-Ct對照內參基因）-（Ct處理目的基因-Ct處理內參基因）

24高效液相電化學法測定結腸中5HT的含量[12]治療結束后，動物斷頭處死，截取距大鼠肛門5 cm 處結腸1～2 cm，稱重后加入3倍體積的01 mol·L-1高氯酸溶液，粉碎后勻漿，離心取上清20 μL進樣。色譜條件：流動相緩沖鹽甲醇（96∶4）；流速030 mL·min-1；電化學檢測器工作電壓075 V；進樣量20 μL，柱溫35 ℃。進樣25，5，10，20，40，80 μL求出標準曲線。

25數據統計數據以±s表示，采用SAS82軟件進行統計分析。多個樣本均數比較用單因素方差分析（OneWay ANOVA），其中方差齊者用LSD法進行組間比較，方差不齊者采用Dunnett′s T3法進行組間比較。以P<005判斷差異顯著性。

3結果

31纈草醛對IBS模型大鼠結腸CRF表達的影響CRF主要表達在腸黏膜固有層和下層的胞漿中，陽性細胞呈棕褐色。對照組的陽性細胞數量少，著色較淺；IBS模型組的陽性細胞數量較對照組明顯增多，著色較重；纈草醛各劑量組及匹維溴銨組的陽性細胞數量較模型組有所減少，著色較淺。各組大鼠的總IOD值均高于對照組（P<005），說明孤養結合慢急性不可預見性刺激的造模方法能夠促進大鼠結腸CRF的表達；對照組與纈草醛高劑量組的IOD值低于模型組（P<005），見圖1，表1。

陶絲雨等：纈草醛對腸易激綜合征模型大鼠結腸CRF，TPH1 mRNA及5HT表達的影響

32纈草醛對IBS模型大鼠結腸TPH1 mRNA表達的影響與對照組比較，IBS模型組大鼠結腸中TPH1 mRNA表達明顯增高（P<005），與IBS模型組比較，纈草醛中、低劑量組及匹維溴銨組大鼠結腸中TPH1 mRNA表達下降明顯（P<005），見表2。

33纈草醛對IBS模型大鼠結腸5HT含量的影響以峰面積為縱坐標，5HT質量為橫坐標，得到標準曲線Y=20 418X+25 941，R2=0996；以峰面積為縱坐標，此方法線性良好，可用于生物樣品中5HT含量測定。實驗結果見表3，與對照組相比較，模型組5HT含量明顯升高（P<005），纈草醛高、中、低劑量組較模型組5HT含量明顯下降（P<005）。

4討論

苗藥蜘蛛香是敗醬科纈草屬植物的根及根莖，曾載《本草綱目》，1977年版和2010年版《中國藥典》（一部）中亦有收載。蜘蛛香性味辛、苦、溫，用于治療胃腸道疾病有較好的療效，如消化不良，嘔吐腹瀉，小兒疳積、腹脹、食少、胃氣痛等[13]。纈草醛（baldrinal）是蜘蛛香中環烯醚萜類降解后的主要成分，結構穩定，提取分離量大[14]。

現代研究表明，IBS的發病機制主要包括內臟感知障礙、胃腸動力異常以及胃腸分泌異常等，5羥色胺（5HT）作為一種具有多種生物功能的廣泛存在于中樞神經系統和胃腸道的神經遞質，被發現積極參與了上述生理病理過程，并與IBS患者腹痛、腹瀉及內臟敏感等癥狀密切相關[15]。腸道內5HT的增加，會導致腸神經系統（enteric nervous system，ENS）高度敏感，激活多種神經活性物質，導致腦腸軸內信號異常；而5HT還作用于相關受體，導致患者腸道的感知、運動和分泌改變，產生IBS的癥狀[1617]。

促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）是一種能夠介導下丘腦垂體腎上腺軸（HPA軸）產生各種應激反應的關鍵調節肽。應激可以刺激下丘腦的神經內分泌細胞釋放CRF，CRF能夠激活肥大細胞，使其脫顆粒釋放5HT，改變胃腸動力，提高內臟敏感性。因此，CRF可能通過對5HT表達的調控來影響IBS的內臟敏感性[1820]。

色氨酸羥化酶（TPH）是機體外周系統合成5HT的關鍵限速酶，TPH1是其主要異構體之一，主要在腸嗜鉻細胞（EC）中表達。TPH1可以介導EC細胞重攝取的色氨酸（Trp）分解成為5羥色氨酸（5HTP），進而脫羧生成5HT。因此，TPH1直接影響5HT的生成，其表達的增強會引起5HT水平的升高[21]。應激狀態下，CRF與TPH1同時作用，促進5HT的分泌與生成，導致結腸5HT水平的異常升高，從而產生IBS的相關癥狀[22]。

課題組前期研究發現，慢性應激可以使IBS大鼠5HT分泌增加，EC細胞數量增多，內臟敏感性增加，而束縛應激也可以促進EC細胞釋放5HT[2324]。本實驗中采用孤養結合慢急性不可預見性應激法制備腸易激綜合征大鼠模型[25]，結果表明，IBS模型組大鼠結腸組織中CRF與TPH1表達均顯著升高，5HT含量也明顯升高，說明5HT含量升高可能與CRF，TPH1表達升高有關，而5HT的異常升高會導致腸道內臟敏感性和腸道動力異常，證明CRF和TPH1的表達異常與IBS的發生有密切關系。給予纈草醛治療后，纈草醛能夠明顯降低IBS模型大鼠結腸內5HT的含量，結腸中CRF，TPH1表達較模型組顯著下降，說明纈草醛可能是通過降低IBS模型大鼠結腸CRF的表達水平，影響肥大細胞釋放5HT；通過調控TPH1影響了5HT的合成，降低了結腸內5HT的含量，從而改善了IBS的相關癥狀。

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[責任編輯張寧寧]

[收稿日期]20160907

[基金項目]國家自然科學基金項目（81374044）；校級自主課題項目（2016JYBXS028）

[通信作者]*閆興麗，博士，研究員，研究方向：傳統中醫藥用藥規律、作用規律及應用基礎研究，Email：xingliyan3@126com

[作者簡介]陶絲雨，碩士研究生，Email：siluhuayu9229@163com