正交法優(yōu)選愈骨葆方的最佳水提取工藝

饒麗+金小冬+李青南+盧麗

[摘要]采用正交試驗方法研究愈骨葆方的最佳水提取工藝。通過血清藥理學(xué)，以提取物對成骨細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）的活性的影響作為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表設(shè)計試驗，對加水量（A）、加熱時間（B）、浸泡時間（C）及煎煮次數(shù)（D）4個因素進(jìn)行考察，分析最佳提取條件，并驗證該工藝的有效性。通過該實驗得出愈骨葆方最佳提取工藝：8倍加水量，加熱時間60 min，浸泡時間30 min，煎煮1次。按此工藝獲得的愈骨葆方含藥血清能顯著地促進(jìn)成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。該實驗建立了愈骨葆方的最佳提取工藝，為該復(fù)方中藥的開發(fā)利用提供了試驗依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]愈骨葆方； 正交試驗； 水提取工藝； 成骨細(xì)胞； 堿性磷酸酶

Optimize aqueous extract protocol for Yugubao formula by

orthogonal experiment design

RAO Li， JIN Xiaodong， LI Qingnan， LU Li*

（College of Life Science and Biological Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangdong Provincial

Key Laboratory of Biotechnology Candidate Drugs， Guangzhou 510006， China）

[Abstract]To determine the optimum aqueous extract protocol for Yugubao traditional Chinese medicines formula by using orthogonal experiment design Through serum pharmacology research， L9（34） orthogonal design with single factor investigation was used to optimize the aqueous extract protocol for Yugubao formula The effect of water extraction on activity of alkaline phosphatase （ALP） in osteoblast was referred as the evaluation index for investigating four factors： water consumption （A）， heating time （B）， soaking time （C）， and number of decocting （D）， analyzing the optimum extraction conditions， and verifying the effectiveness of this process The optimum aqueous extract protocol for Yugubao was as follows： adding 8 times water into Chinese medical materials， heating for 60 min， soaking for 30 min， and decocting for 1 time The drug serum of this aqueous extract of Yugubao could significantly upregulate the osteogenic genes expression The optimum aqueous extract protocol for Yugubao formula was established in this experiment， providing evidence for the development and utilization of Yugubao traditional Chinese medicines formula

[Key words]Yugubao formula； orthogonal design； aqueous extract； osteoblast； ALP

近年來，骨科創(chuàng)傷的發(fā)生率高居不下，首要原因是交通事故，隨著工業(yè)及城市化高速發(fā)展，骨科創(chuàng)傷的患者也大量增加，尤以重癥患者增長率為高。骨科創(chuàng)傷給病人造成極大痛苦的同時，也帶來的巨大經(jīng)濟損失，這使得骨傷骨折治療藥物的研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化越來越受到重視。中醫(yī)對骨折的認(rèn)識與治療歷史悠久，接骨類中藥作為中藥的優(yōu)勢藥種，具有西醫(yī)西藥難以比擬的優(yōu)勢。這使得開發(fā)更有效、更安全的新型接骨類中成藥成為趨勢。愈骨葆方，系由骨碎補、杜仲、續(xù)斷等組成的內(nèi)服方劑，此方根據(jù)“君、臣、佐、使”的配伍，采用補肝腎，益精血，調(diào)理陰陽的治則，兼顧頭頸、背腹及四肢，輔以養(yǎng)血活血，強筋壯骨之法，兼有止痛鎮(zhèn)靜的作用。已在民間應(yīng)用近70余年，對骨傷骨折有確切的療效，尤其是對老年骨質(zhì)疏松合并骨折的患者，能明顯加快骨痂生長，縮短骨折愈合時間，與化學(xué)藥乃至同類中藥相比，都具有較強競爭力。

為了確保愈骨葆方經(jīng)水提取后能維持穩(wěn)定的藥效，本實驗旨在愈骨葆方最佳的水提工藝。本研究采用傳統(tǒng)的正交試驗設(shè)計法，結(jié)合單因素考察，選用L9（34）正交設(shè)計試驗，通過血清藥理學(xué)，即以含藥血清代替中藥粗提物作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中從而研究其藥理作用的一種半體內(nèi)實驗方法，以愈骨葆方提取物制備的大鼠含藥血清對成骨細(xì)胞分化值[1]的高低作為考察指標(biāo)，對加水量（A）、加熱時間（B）、浸泡時間（C）及煎煮次數(shù)（D）4個因素進(jìn)行優(yōu)化，篩選出愈骨葆方的最佳水提取工藝。

1材料

11愈骨葆方復(fù)方包含骨碎補、杜仲、續(xù)斷、千年健、川芎、玄胡、細(xì)辛，所需飲片均購于廣東大參林藥房，由廣州市番禺區(qū)何賢醫(yī)院藥房李艷卿副主任藥師鑒定，低溫干燥避光保存。

12動物新生24 h內(nèi)SD大鼠乳鼠6只，雌雄兼用，每只約15 g。SPF級SD雌性大鼠30只，體重230～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK（粵）20080020。

13試劑DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，批號SH30021 01B）、025%胰酶溶液（GIBCO批號25200056）、膠原酶Ⅰ（Invitrogen公司，批號17101015）、PBS緩沖液（Hyclone公司，批號SH30256 01B），β甘油磷酸鈉（Sigma公司，批號BCBB4821），L維生素C（Sigma公司，批號037K02501），地塞米松（Sigma公司，批號100827），堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號A0591）。

2方法

21成骨細(xì)胞（osteoblasts，Ob）原代培養(yǎng)及鑒定無菌條件下取出新生鼠的顱蓋骨，置入冷PBS中，剔除附著的結(jié)締組織。用PBS液清洗3次，將其置入盛有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剪成05 mm×05 mm大小碎塊，加入025%胰蛋白酶5 mL，37 ℃下預(yù)消化20 min[2]，血清終止消化，棄上清液，將骨片移入5 mL 01%Ⅰ型膠原酶溶液中，37 ℃震蕩消化分離細(xì)胞60 min，將含細(xì)胞的消化液1 000 r·min-1離心10 min，吸去上清液，沉淀的細(xì)胞團塊用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，剩下的骨片用含5 mL 01%Ⅰ型膠原酶溶液重復(fù)消化分離細(xì)胞60 min。將2次消化獲得的細(xì)胞懸液混勻，計數(shù)。按需要密度接種于培養(yǎng)瓶或皿，置5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h換液1次，去除不貼壁的死亡細(xì)胞，以后每2～3 d換液1次[34]。取3～5代的細(xì)胞，進(jìn)行堿性磷酸酶染色，陽性顏色顯示為藍(lán)色。倒置相差顯微鏡下觀察，拍照。

22大鼠給藥量的計算參考《藥理實驗方法學(xué)》，采用標(biāo)準(zhǔn)動物的等效劑量折算系數(shù)法[5]，折算出大鼠的給藥量。計算方法：大鼠的劑量（mg·kg-1）=人的臨床劑量（mg·kg-1）×70 kg×0018/02 kg=63×人的臨床劑量（mg·kg-1）。其中0018為折算系數(shù)；人體重按70 kg計算，大鼠體重按02 kg計算。愈骨葆方臨床給藥量1 d為0214 g·kg-1，所以大鼠的劑量為135 g· kg-1。由于大鼠灌胃量為每100 g體重1～2 mL[5]，所以擬定藥物質(zhì)量濃度為02 g·mL-1。按大鼠平均體重為250 g計算，每天灌胃1次，每次灌胃量約為17 mL。

23正交試驗設(shè)計選取正交試驗設(shè)計優(yōu)化的方法，結(jié)合生產(chǎn)實際中的操作和成本問題及該中藥復(fù)方的特性，采用水提工藝，確定加水量、加熱時間、浸泡時間、煎煮次數(shù)4個因素，以L9（34）正交表設(shè)計試驗，通過血清藥理學(xué)，以提取物對成骨細(xì)胞分化值高低作為考察指標(biāo)。影響因素及水平見表1。按比例稱取該中藥復(fù)方各單味藥飲片共900 g，分成9等分每份各100 g，按照所設(shè)計的試驗處理組合方法煎煮，8層紗布過濾，合并濾液并水浴濃縮至02 g·mL-1，即濃縮液為50 mL。

24大鼠含藥血清制備取大鼠30只，隨機分為10組，每組各3只，中藥復(fù)方組按上述正交試驗得到的9組愈骨葆方濃縮液進(jìn)行灌胃，空白對照組灌等量的生理鹽水。每天1次，連續(xù)5 d，末次灌胃后1 h心臟取血[6]，室溫下靜置4 h，3 000 r·min-1離心15 min，取血清，每組血清混勻，于56 ℃水浴30 min滅活，-20 ℃保存。配制時采用022 μm的微孔濾膜過濾，與無血清的DMEM配成10%的含藥血清培養(yǎng)基和空白血清培養(yǎng)基。

25成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALP含量的測定取對數(shù)生長期良好的F2代成骨細(xì)胞經(jīng)025%胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞、計數(shù)，以相同密度（2×103個/孔）接種于96孔培養(yǎng)板，容積為100 μL/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后換入上述制備的含藥血清培養(yǎng)基和空白血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，一共分為10組，每組設(shè)5個復(fù)孔。48 h后ALP試劑盒檢測。檢測各組520 nm培養(yǎng)成骨細(xì)胞上清的ALP吸光度（A）[78]。數(shù)值大代表藥效越強。

26Real timePCR按經(jīng)優(yōu)化后的方法提取愈骨葆方水提物，給大鼠灌胃后獲得含藥血清，將含藥血清加入成骨細(xì)胞培養(yǎng)基，空白血清作為對照組。成骨細(xì)胞經(jīng)含藥血清及空白血清處理3或7 d。Trizol提取細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real timePCR檢測，Real timePCR引物序列見表2。檢測結(jié)果與內(nèi)參βactin進(jìn)行比較，相對定量。

3結(jié)果

31成骨細(xì)胞鑒定

倒置相差顯微鏡下，剛接種的成骨細(xì)胞呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中并逐漸沉降貼壁，24 h存活細(xì)胞已完全貼壁展開。展開后的細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多呈三角形、多角形，有較多突起，單核呈卵圓形，含1～2個核仁，胞漿豐富、清晰，見圖1，2。

32空白血清以及正交試驗

得到的9組愈骨葆方含藥血清對成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液ALP含量的影響見表3，正交試驗得到的9組愈骨葆方含藥血清，除方案7以外，其他各組方案均能增加成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP含量，與對照組比較差異顯著（P<005，P<001）。

33水提L9（34）正交試驗

試驗數(shù)據(jù)用正交試驗設(shè)計軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。由表4可知，最佳提取工藝組合應(yīng)為A1B2C1D1，即加8倍水，加熱60 min，浸泡30 min，提取1次。表5方差分析表明，C>A>D>B，說明浸泡時間對Ob分化值影響最大，其次為加水量和煎煮次數(shù)，加熱時間影響較小；F檢驗結(jié)果表明，浸泡時間對成骨細(xì)胞分化值影響顯著，其次為加水量、煎煮次數(shù)和加熱時間。

34愈骨葆方含藥血清對成骨功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

按最佳水提工藝提取的愈骨葆方水提物，經(jīng)大

鼠灌胃后得到含藥血清能顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞中成骨功能相關(guān)基因表達(dá)，見圖3。Real timePCR 檢測結(jié)果表明，與對照組相比，該愈骨葆方含藥血清顯著地提高成骨細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osx的轉(zhuǎn)錄水平，同時顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞標(biāo)志基因ALP，Col I，OPN，OCN的轉(zhuǎn)錄。

4討論

本課題研究的中藥組方——愈骨葆方，經(jīng)過民間長期實踐驗證，是具有確切接骨作用的中藥組方，也是傳統(tǒng)醫(yī)藥中值得大力發(fā)揚的優(yōu)勢藥物。而目前制約新型中成藥開發(fā)最大的障礙就是對復(fù)方中藥組方的分子作用機制不明，以及中成藥的藥效不穩(wěn)定，這涉及藥效研究與藥物制劑兩大方面的問題。本研究的目的就在于明確愈骨葆方的最佳水提工藝，為后續(xù)開展藥效學(xué)評價提供實驗依據(jù)。

愈骨葆方中含量最大的3味“君藥”分別是骨碎補、杜仲和續(xù)斷，其中骨碎補主要含有黃酮、三萜、酚酸及其苷類化合物，現(xiàn)代藥理及臨床研究表明，骨碎補具有良好的促進(jìn)骨折愈合、抗骨質(zhì)疏松等活性[2]。杜仲主要含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、揮發(fā)油類，對成骨細(xì)胞有明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[9]。續(xù)斷具有復(fù)雜和多樣的化學(xué)成分，主要含有三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、揮發(fā)油類等，能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增殖，可能是該藥促進(jìn)骨折愈合、防治骨質(zhì)疏松的機制之一[12]。但由于中藥成分眾多，中藥復(fù)方配伍更是復(fù)雜多變，除了有效成分外，很多雜質(zhì)，如鞣質(zhì)，電解質(zhì)等，或是藥物的酸堿度都可能會對體外的細(xì)胞、器官或組織等產(chǎn)生一些不必要的影響，制約著體外研究的進(jìn)行。中藥血清藥理學(xué)的出現(xiàn)在很大程度上克服了中藥復(fù)方及粗提物在體外研究時的不便，具有可控性好，重復(fù)性高，可以減少各種干擾因素的影響，使得中藥復(fù)方藥理作用機制的深入研究成為可能[13]，所以采用中藥血清藥理學(xué)的方法去評價篩選愈骨葆方的最佳水提工藝。

中藥血清藥理學(xué)是由日本學(xué)者田代真一于1987年首次提出的，是為了研究中藥復(fù)方而誕生的一種新的體外實驗方法[10]。它能透過有效成分在血中的動態(tài)變化、相互作用及與藥效的相互關(guān)系，更好地反映中藥復(fù)方的配伍原則和藥物的量效關(guān)系，并在一定程度上揭示中藥及其復(fù)方在胃腸內(nèi)處置過程中活性成分的轉(zhuǎn)化與改變[13]。作為愈骨葆方中的主要成分，有研究證實骨碎補總黃酮含藥血清具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化成熟，以及抑制成骨細(xì)胞發(fā)生早期凋亡的作用[14]；而杜仲水提物含藥血清能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并刺激細(xì)胞增殖[15]；這提示愈骨葆方含藥血清可能含有相似活性物質(zhì)而對成骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用。

本次實驗通過正交試驗，以愈骨葆方含藥血清對成骨細(xì)胞分化值高低作為考察指標(biāo)，篩選出愈骨葆方的最佳水提工藝。最后采用Real timePCR法去驗證正交實驗所獲得的愈骨葆方水提物含藥血清的促成骨功能。其中，Runx2和Osx是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是其分化與成熟早期的特異性標(biāo)志物。Col Ⅰ和ALP 是成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志物。OPN和OCN則是成骨細(xì)胞分化晚期的特異性標(biāo)志，一般在骨礦化是達(dá)到表達(dá)峰值。愈骨葆方含藥血清顯著促進(jìn)這些成骨功能相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，表明該含藥血清顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟。

綜上，本實驗采用含藥血清法及正交實驗法確立了愈骨葆方的最佳水提取工藝，并驗證了該工藝的有效性，這為愈骨葆方后期的系統(tǒng)藥效學(xué)評價及藥物開發(fā)提供了有力的實驗依據(jù)。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]

[收稿日期]20160812

[基金項目]國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81203003）

[通信作者]*盧麗，副教授，碩士生導(dǎo)師， Email：541608180@qqcom

[作者簡介]饒麗，碩士研究生，Email：1961874835@qqcom