白虎加桂枝湯對熱痹模型大鼠特征性甲基化基因表達的影響

陳歡+巨少華+魏江平+付文君+鄭航+徐世軍

[摘要]考察濕熱環境下熱痹模型大鼠特征性甲基化基因及白虎加桂枝湯對熱痹特征性甲基化基因的調控作用。采用大鼠足底注射CFA并復合濕熱環境制備熱痹大鼠模型。造模后第15天給予白虎加桂枝湯干預治療30 d。造模后每隔4 d檢測足容積，第45天采用HE染色法檢測大鼠踝關節組織病理學，MeDIPSeq測序法檢測大鼠膝關節滑膜甲基化水平并以取差集的方法篩選熱痹模型特征性甲基化基因，懸浮芯片檢測血清中IL1β，IL17，TNFα，EGF，IL12p70，IL4，IL6及IFNγ含量水平，qRTPCR檢測大鼠滑膜特征性甲基化基因mRNA相對表達水平。實驗發現，與完全弗氏佐劑性關節炎（AA）模型組比較，熱痹模型組足腫脹度和病理嚴重程度僅輕微增加；與空白組比較，2個模型組全基因CpG島均呈低甲基化狀態，熱痹模型組甲基化水平最低，且AA模型組共705個差異性甲基化基因，熱痹模型組共2 418個差異性甲基化基因；與AA模型組比較，熱痹模型組存在1 287個差異性甲基化基因，其中共974個差異性基因甲基化下調，這些差異性基因顯著分布于32個KEGG Pathway中（P<005），此外啟動子區上熱痹特征性甲基化基因共52個，其中36個甲基化下調基因，16個甲基化上調基因；藥物干預后，白虎加桂枝湯顯著改善熱痹模型組足腫脹度和病理損傷，且明顯降低IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17，IL12p70的含量水平（P<005），還能抑制熱痹特征性甲基化下調基因Ahcy及Rpl3 mRNA的表達，促進熱痹特征性甲基化上調基因Agxt mRNA的表達水平。可見，熱痹模型滑膜基因存在獨特的甲基化水平變化，而白虎加桂枝湯可能針對性回調熱痹特征性基因的甲基化水平，達到治療熱痹的作用。

[關鍵詞]熱痹； DNA甲基化； 濕熱環境； 白虎加桂枝湯

Effect of Baihu Guizhi decoction on characteristic methylation genes

expression of pyretic arthralgia rat model

CHEN Huan1，2， JU Shaohua1，2， WEI Jiangping1，2， FU Wenjun1，2， ZHENG Hang1，2， XU Shijun1，2*

（1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；

2 Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine Resources in Sichuan Province，

Chengdu 611137， China）

[Abstract]To investigate the characteristic methylation genes of pyretic arthralgia model in hot and dampness environment and the regulation effect of Baihu Guizhi decoction on this characteristic methylation genes Plantar injection of CFA was used in hot and dampness environment to induce the pyretic arthralgia rat models From 15th day after modeling， Baihu Guizhi decoction was given for 30 days Foot volume was detected every 4 days after modeling， and HE staining was used to detect the histopathology of all rats′ ankle joint at day 45MeDIPSeq sequencing method was used to detect the methylation level of knee joint synovial， and the method of difference sets was used to screen the characteristic methylation genesinpyretic arthralgia modelsThe contents of IL1β， IL17， TNFα， EGF， IL12p70， IL4， IL6 and IFNγ in serum were measured by using suspension chips The mRNA expression level of characteristic methylation genes was measured by qRTPCR The results suggested that as compared with adjuvant arthritis rat models（AA）， the foot swelling and histopathology inpyretic arthralgia models （PA） were only slightly increased As compared with normal group （NG）， the wholegenome CpG island in both AA and PA groups was kept in a lower methylation state， furthermore， the methylation level was lowest in PA group； with 705 difference methylation genes in AA group and 2 418 difference methylation genes in PA group As compared with AA， there were 1 287 difference methylation genes， including 974 downregulated methylation genesand 313 upregulated methylation genes This difference methylation genes were mostly enriched in 32 KEGG pathways Moreover， there were 52 characteristic methylation genes of PA models in promoter region， including 36 downregulatedmethylation genes and 16 upregulatedmethylation genes After drug intervention， Baihu Guizhi decoction improved the foot swelling and pathological injury in PA models， significantly decreased the levels of IL1β， TNFα， EGF， VEGF， IL17， IL12p70， inhibited the mRNA expression levels of downregulated methylation genes AHCY and RPL3， and promoted the mRNA expression levels of upregulated methylation gene Agxt In conclusion， unique methylation changes of synovial genes were present in PA models， and Baihu Guizhi decoction may adjust the methylation level of PA′s characteristic methylation genes to achieve the therapeutic effect of pyretic arthralgia

[Key words]pyretic arthralgia； DNA methylation； hot and dampness environment； Baihu Guizhi decoction

痹證是中醫臨床常見的病癥，其多因正氣不足，感受風、寒、濕、熱等外邪引起，由此可見，外界風寒濕熱等環境因素與痹證的發生密切相關，而濕與熱又常作為熱痹發病的誘因之一。表觀遺傳學作為環境因素影響基因表型的中間橋梁，常用于研究疾病的發病機制，其中DNA甲基化研究最為廣泛[1]。與疾病發生相關的基因啟動子區甲基化水平降低，導致致病基因表達增加，誘發或促使疾病發生，可見基因啟動子區甲基化水平與基因的表達水平呈負相關[23]。白虎加桂枝湯是治療熱痹的經典方劑，其藥理學機制主要集中于調節機體免疫和緩解炎癥反應[45]，是否還存在其他的治療機制仍需進一步研究。完全弗氏佐劑性關節炎大鼠（AA）模型其病理表現與人類類風濕性關節炎（RA）十分相似，常作為研究RA發病機制的動物模型[6]，而RA在中醫認知中，將其歸屬與“痹證”范疇，根據 “病因模擬”原理，本實驗在經典AA模型的基礎上復合濕熱環境，制備符合中醫熱痹證候的動物模型，并在此基礎上采用甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIPSeq）測序方法考察了熱痹特征性甲基化基因，并初步探討了白虎加桂枝湯治療熱痹的表觀遺傳學機制。

1材料

11動物

SPF級SD大鼠，體重180～220 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物合格證號SCXK（川）201324。

12藥物與試劑

白虎加桂枝湯，其藥物組成及用量參考上海中醫學院1982年版《中醫方劑與臨床手冊》，為石膏60 g、知母15 g、甘草5 g、粳米30 g、桂枝10 g。藥材均購于成都市荷花池藥材市場，由成都中醫藥大學馬云桐教授鑒定。藥物配制方法如下：知母、甘草、粳米、桂枝溫水浸泡1 h，石膏單獨先煎30 min后加入其他藥物，加水至1 000 mL，保持微沸，煎煮30 min，紗布過濾；取藥渣加水500 mL二次煎煮20 min，紗布過濾并與第一次濾液合并，濃縮至2 g·mL-1，各給藥組均以2 g·mL-1溶液稀釋至給藥濃度。

醋酸地塞米松（浙江仙琚制藥股份有限公司，20140609）；完全弗氏佐劑（CFA）（Sigma，F588110 mL）；MILLIPLEX xMAP Rat Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Immunology Multiplex Assay Kit （Millipore，USA，RECYTMAG65K11）；Magnetic Methylated DNA Immunoprecipitation kit（Millipore，ME10025）；QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，155231102）；PairedEnd DNA Sample Prep kit（Illumina，PE1021002）；iScript cDNA Synthesis Kit（BIORAD，100 reaction）；FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）（Roche，5 mL）；TriPure Isolation Reagent（Roche，200 mL）。

13儀器

Luminex 200（Millipore，Magpix）；Nanodrop（Thermo Scientific Co Ltd，2000）；Illumina Hiseq（Illumina，2000）；實時熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems Inc，7900 HT）；紫外分光光度計（Thermo Scientific，NANODROP2000）；凝膠成像儀（GE，ImageQuant300）。

2方法

21分組與造模

60只SD大鼠剔除體重不合格者4只，其余54只大鼠隨機分為7組，每組8只，分組為：空白組（NG）、完全弗氏佐劑性關節炎模型組（AA）、熱痹模型組（RB）、地塞米松組（DXM）、白虎加桂枝湯高劑量組（BHG）、白虎加桂枝湯中劑量組（BMG）、白虎加桂枝湯低劑量組（BLG）。各組大鼠于常規實驗環境下適應性喂養3 d。造模方法如下：除NG組大鼠右后足底皮下注射01 mL生理鹽水外，其余各組均注射01 mL CFA。RB，BHG，BMG，BLG 4組大鼠自注射01 mL CFA第1天起，均置于溫度為375 ℃，相對濕度為70%～80%的環境中，每天2 h，直至45 d，其余時間常規飼養。

22給藥

造模15 d后，DXM（5 mg·kg-1），BHG（28 g·kg-1），BMG（14 g·kg-1），BLG（7 g·kg-1）4組大鼠按20 mL·kg-1體積灌胃給藥，每天1次，連續30 d。

23大鼠足腫脹度的測定

測定造模前和自造模后第6天起，每隔4 d后大鼠的足容積。足腫脹度計算公式為：造模后足容積-正常足容積。

24大鼠踝關節滑膜組織病理學檢測

第45天給藥后，剪取大鼠踝關節，10%甲醛固定，10%EDTA脫鈣，乙醇梯度脫水，二甲苯脫酒精，石蠟包埋，切片（5 μm）；切片脫蠟，蘇木素伊紅染色，封片，鏡檢。

25大鼠血清因子含量水平檢測

造模后第35天，各組大鼠尾靜脈取血并分離血清。按照MILLIPLEX xMAP Rat Cytokine/Chemokine Magnetic Bead PanelImmunology Multiplex Assay Kit說明書檢測血清中IL1β，IL17，TNFα，EGF，IL12p70，IL4，IL6及IFNγ的含量水平。

26熱痹模型大鼠滑膜甲基化水平檢測及熱痹特征性甲基化基因篩選

根據NG，AA及RB 3組大鼠血清因子檢測結果，根據IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17及IL12p70的結果，做聚類分析，剔出3組中各自離散度大的動物，各篩選出3只大鼠進行后續試驗。造模后第44天，處死NG，AA及RB 3組中挑選出的大鼠，取膝關節滑膜。按照QIAquick Gel Extraction Kit說明書中組織樣本DNA提取方法，提取各大鼠滑膜DNA，并將DNA樣本立刻送華大基因進行MeDIPSeq測序。將NG相對RB啟動子區甲基化基因和 NG相對AA啟動子區甲基化基因以取差集的方式，找出熱痹模型特征性甲基化基因。

27白虎加桂枝湯對熱痹模型大鼠滑膜特征性甲基化基因表達的影響

造模后第45天，剝離大鼠后肢膝關節滑膜，并提取總RNA，逆轉錄為cDNA，作為模版進行PCR。擴增引物為：βactin上游引物為5′CTGGAGAAGAGCTATGAG3′，下游引物為5′ATGATGGAATTGAATGTAGTT3′；Ahcy上游引物為5′GTCCACAACCTCTACA3′，下游引物為5′CTTGGTGACAGAATCG3′；Rpl3上游引物5′AACAGAGATCAACAAGAAGA3′，下游引物為5′CAGGTCGTAGTCAGTAGA3′；Agxt上游引物為5′GAAGTCTGAGGATGATTGG3′，下游引物為5′TCTGGAACACATACTGGAT3′。

反應體系：5x iScript Reaction Mix 12 μL，iScript Reverse Transcriptase 3 μL，Nucleasefree water 30 μL，RNA template 15 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應40個循環，整個熒光定量PCR通過ABI 7900 HT Realtime PCR System以及7900 System SoftwareSDS 24（Applied Biosystems）進行。

28統計方法

數據均采用±s表示，數據采用單因素方差分析及非參數檢驗；DNA甲基化數據采用R語言、PCA和FC的計算方法；分析2組樣品間的 peak 相關差異基因，采用卡方檢驗，并做 FDR 檢驗去除假陽性。

3結果

31各檢測時間點大鼠足腫脹度變化

與NG組比較，AA組與RB組足腫脹度顯著升高（P<005）；與AA組比較，RB組足腫脹度于各檢測點僅有升高趨勢，第21天最明顯，但無統計意義；與RB組比較，白虎加桂枝湯高、低劑量組給藥30 d后，足腫脹度明顯降低（P<005），見表1。

32大鼠踝關節滑膜病理變化

病理結果顯示，NG組大鼠踝關節滑膜正常；AA組較NG組可見滑膜輕度增生、滑膜細胞輕度腫脹，

滑膜炎性細胞中度浸潤，輕度纖維化；RB組可見滑膜細胞增生和炎性細胞浸潤較AA組嚴重，但未見滑膜細胞腫脹及纖維化；給予藥物白虎加桂枝湯干預后，滑膜炎性增生和浸潤明顯改善，見圖1。

33白虎加桂枝湯對大鼠血清炎癥因子含量水平的影響

與NG比較，AA和RB 2組大鼠血清各因子含量均明顯升高（P<005）；與AA比較，RB大鼠血清中IL1β，TNFα和VEGF的含量顯著升高（P<005）；與RB比較，BHG，BMG顯著降低IL1β，TNFα，EGF，VEGF，IL17及IL12p70的含量水平（P<005），而BLG對VEGF和IL12p70的含量水平無明顯降低作用。IL6，IL4和IFNγ因其濃度低于檢測線，未檢測出，見圖2。

34熱痹模型大鼠滑膜甲基化水平

341MeDIPSeq序列與參考序列的比對NG，AA及RB 3組大鼠滑膜DNA甲基化測序完成后，統計質量合格的read產出量，3組reads數量產出量均為244，897，960條。與參考基因組進行比對（比對軟件SOAP221，相關網站http：//soap.genomics.org.cn），每條read最多允許2個堿基錯配，可見3組reads比對率均不低于93%。比對結果見表2。

342reads在CpG Island及其上下2 000 bp的平均覆蓋深度分布趨勢CpG島甲基化程度與基因表達存在十分密切的聯系，本實驗結果說明，與NG比較，AA及RB組CpG島DNA甲基化水平均明顯降低，且RB組低甲基化狀態最明顯，見圖3。

343熱痹模型DNA甲基化密度分布情況及各組

差異性甲基化基因將reads映射至參考基因組上，檢測甲基化reads分布的峰值peak，并進一步分析各組甲基化peak在不同基因元件上的密度。結果表明，NG，AA及RB的peak總數分別為253，285，233，338和233，461，與NG比較，AA及RB各基因元件上甲基化密度均減少；而與AA比較，RBUpstream2k，CDS與Intron上甲基化密度增加，而5′UTR，3′UTR和Downstream2k甲基化密度減少，見表3。

合并各組樣本peak區域，統計合并后區域中每個樣本歸一化后的reads數，并采用FDR檢驗去除假陽性結果。根據所選定區域中reads數的差異，將差異區域分為上升和下降，如樣本1與樣本2比較，同一peak區域中樣本2的reads數高于樣本1的reads數的基因，則認為甲基化上調（up），反之為甲基化下調（down）。篩選準則為：P≤001，2個樣本在相同基因元件內都有覆蓋，且覆蓋度的差異在2倍以上。結果顯示，NG相對AA共有390個甲基化上調基因，315個甲基化下調基因，NG相對RB共有307個甲基化上調基因，2 111個甲基化下調基因；AA相對RB共有313個甲基化上調基因，974個甲基化下調基因。結果見圖4。

344熱痹差異性甲基化基因相關KEGG Pathway分析將RB相對AA的差異性基因投射于KEGG Pathway公共數據庫[7]上，通過pathway顯著性富集分析，得到RB相對AA的差異性 KEGG通路。由結果可知，RB差異性甲基化基因主要富集到細胞黏附、鈣信號途徑、MAPK信號通路、T，B細胞受體信號通路、抗原提呈處理等32個通路上。結果見表4。

345熱痹特征性甲基化基因采用整合基因組學瀏覽器（IGV）檢測MeDIPSeq測序的原始數據中的wig壓縮包，剔除組內3個樣本在peak相同區域內存在較大差異的甲基化基因，再經過取差集的方法篩選啟動子區發生差異性甲基化的基因后，分析方法見圖5，得到熱痹特征性甲基化下調基因36個，甲基化上調基因16個。熱痹特征性甲基化基因見表5。

35白虎加桂枝湯對熱痹模型特征性甲基化基因表達的影響

檢測白虎加桂枝湯不同劑量對熱痹特征性甲基化上調基因AGXT及甲基化下調基因AHCY和RPL3 3個基因mRNA表達水平的影響。結果表明與RB比較，BHG與BLG均能降低Ahcy基因mRNA表達水平；BHG，BMG，BLG均能下調Rpl3基因mRNA表達水平；而對于甲基化上調的Agxt，BHG與BMG均能提高Agxt基因mRNA表達水平，見表6。

4討論

風寒濕熱是痹證重要的發病病因。中醫將RA歸屬于痹證，在以往的實驗研究中發現，濕熱環境能使RA模型大鼠滑膜細胞增生程度、CD44表達水平增加，導致RA炎癥和免疫反應加重[89]。本實驗在經典RA大鼠模型基礎上復合濕熱環境，制備熱痹大鼠模型。與申洪波[9]、鎮蘭芳[10]等的研究相比，本實驗表明，給予濕熱環境刺激后大鼠足腫脹度及滑膜病理嚴重程度僅有輕微增加，其原因可能是每日造模時間相對較短，致使濕熱環境對AA模型的作用減弱。

研究表明，DNA甲基化可能改變RA發病關鍵基因的甲基化修飾水平，而參與到RA發病過程中，如CD4+T細胞全基因組出現低甲基化模式[11]，DNA甲基化動態的參與到患者滑膜Th細胞的分化過程中等[12]。本實驗研究結果表明，在CPG島上

AA模型較NG組呈明顯低甲基化狀態，而濕熱環境刺激后，RB組低甲基化狀態進一步擴大，此結果與文獻報道相一致[13]。另外，在基因的各區域中RB較AA大鼠，甲基化下調基因數目均明顯多于甲基化上調的基因數目。熱痹模型甲基化水平低于AA模型的結果和足腫脹度、踝關節病理的結果，說明低甲基化狀態可能是濕熱環境推動AA模型疾病進程的原因之一。KEGG Pathway分析結果顯示，RB與AA的差異性甲基化基因主要集中與炎癥、免疫相關的通路上，如細胞黏附、鈣信號途徑、MAPK信號通路、T，B細胞受體信號通路、抗原提呈處理等，說明濕熱環境可能通過對這些炎癥免疫通路的作用，影響疾病的轉歸。此外，除了炎癥和免疫通路，這些差異性甲基化基因還富集到某些物質合成及代謝通路上，說明濕熱環境另一方面可能造成生物機體代謝系統紊亂引發或加重疾病。

本實驗通過對基因啟動子區域取差集的方法（NG相對RBNG相對AA），扣除了RB與AA因reads倍數差異而共同擁有的甲基化基因，進而得到熱痹特有的甲基化基因，第一次闡述了熱痹滑膜基因存在獨特甲基化變化，這些基因主要編碼與炎癥免疫反應（如Ahcy，Rpl3，Crn2，Map3k14，Stat2）、能量代謝（Fut2，Kcnj11，Stat2）、DNA及RNA轉錄（Sertad1）、細胞成分（Sertad1）等相關的蛋白，與關節炎，自身免疫性疾病，代謝紊亂等疾病有關。說明濕熱環境可能通過特異性改變這些基因的甲基化水平，參與到熱痹疾病進程中。

白虎加桂枝湯抗炎和提高機體免疫能力效果顯著[1415]。本實驗從減輕熱痹大鼠足腫脹度、踝關節滑膜炎性細胞浸潤、滑膜細胞增生及降各炎癥因子含量三方面，證明了白虎加桂枝湯抗炎作用明顯。除此之外，首次從表觀遺傳學角度探討了其對熱痹特征性甲基化基因表達水平的影響。眾所周知，基因啟動子區域發生甲基化程度與基因的表達水平呈負相關[16]。本實驗表明，白虎加桂枝湯能上調熱痹特征性甲基化上調基因AGXT的表達水平，下調熱痹特征性甲基化下調基因AHCY和RPL3的表達水平，其中AGXT編碼的蛋白參與cAMP，絲氨酸轉氨酶活性，丙氨酸代謝等過程，而RPL3編碼的蛋白參與細胞對IL4反應過程和轉錄過程中，AHCY編碼的蛋白參與抗原刺激性炎癥反應，實驗性關節炎等過程。以上結果說明，白虎加桂枝湯可能影響熱痹特征性基因的甲基化水平扭轉因外界濕熱環境引起的甲基化異常變化，這可能是白虎加桂枝湯治療熱痹的表觀遺傳學機制之一。當然，實驗還需要進一步完善，如檢測白虎加桂枝湯各劑量組大鼠滑膜全基因組甲基化水平，并和熱痹模型組全基因組甲基化進行對比，以及考察白虎加桂枝湯對多個熱痹特征性甲基化基因表達的影響等。

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[責任編輯張寧寧]

[收稿日期]20161009

[基金項目]國家自然科學基金面上項目（81273900）；中藥藥理四川省青年科技創新研究團隊（2014TD0007）

[通信作者]*徐世軍，Tel：（028）61800231，Email：docxu@126com

[作者簡介]陳歡，博士研究生，主要從事中藥抗炎與免疫藥理學研究，Email：rata555@163com