熱補針法對寒證類風濕關節炎模型家兔滑膜組織代謝物譜的影響

袁 博 王金海 方曉麗 張星華 田 亮 張婷卓 李興蘭 杜小正 曾華宗

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

熱補針法對寒證類風濕關節炎模型家兔滑膜組織代謝物譜的影響

袁 博 王金海1方曉麗 張星華 田 亮 張婷卓 李興蘭 杜小正 曾華宗2

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討比較不同針法對寒證類風濕關節炎(RA)模型家兔滑膜組織代謝物譜的影響及熱補針法治療RA的特異性機制。方法 40只清潔級青紫藍家兔隨機分為正常組、模型組、平補平瀉組、捻轉補法組、熱補針法組，每組8只。以卵蛋白誘導聯合低溫冷凍法建立寒證RA模型。除正常組、模型組外，其余各組分別于足三里穴施以平補平瀉、捻轉補法、熱補針法針刺，1次/d，留針30 min，共7次。治療結束后分離家兔膝關節滑膜組織，采用液相色譜-四級桿飛行時間質譜(LC-Q/TOF-MS)檢測滑膜組織代謝物，利用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)方法對數據進行統計分析。結果 與正常組比較，模型組滑膜組織代謝物變化主要體現于丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸、鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂、肌酸、異亮氨酸/亮氨酸、纈氨酸含量降低(P<0.05)；與模型組比較，各針刺組上述代謝物含量增高(P<0.05)，且熱補針法組肌酸、異亮氨酸/亮氨酸、纈氨酸含量明顯高于平補平瀉組和捻轉補法組。結論 熱補針法通過調節與RA能量代謝相關的氨基酸代謝，在改善RA機體氨基酸的供給及減緩負氮平衡方面有一定的特異性作用。

熱補針法；類風濕關節炎；滑膜組織；代謝組學；液相色譜-質譜

類風濕關節炎(RA)是一種以關節滑膜炎為主要病理改變的自身免疫性疾病。針灸療法對RA具有抗炎鎮痛、免疫調節作用〔1〕。“熱補針法”是鄭魁山教授在傳統針刺手法的基礎上，把握“燒山火”之精髓，去繁就簡而創立的特色手法，是臨床治療RA的結晶。課題組前期的研究表明，熱補針法對RA在抗炎鎮痛層面具有相對的特異性〔2〕，但前期這些研究尚不能體現針灸多靶點、多層次、多途徑以及類似于網絡結構的作用特點，缺乏對針刺后機體產生的全部生物信息的綜合分析。代謝組學是通過對某一生物、細胞或組織相對分子質量較低(相對分子質量<1 000)的代謝產物進行定性、定量分析檢測，從系統生物學角度研究機體發病以及治療機制的新技術〔3〕。因此，該研究手段的優勢與針灸治療作用特點甚相吻合。本研究以寒證RA模型家兔為載體，采用液質聯用技術從系統生物學角度探討熱補針法治療RA的特異性機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康2～3月齡清潔級青紫藍家兔40只，雌雄各半，體重(2.5±0.5)kg(購自衛生部蘭州生物制品研究所，許可證號：SCXK(甘)2012-0001)。購回后適應性飼養7 d，然后隨機分為正常組、模型組、平補平瀉組、捻轉補法組、熱補針法組，每組8只。實驗過程中對所有動物的處理方法均符合2006年國家科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導意見》的規定。

1.2 主要試劑及儀器 卵蛋白干粉(sigma 公司，批號：A5253-250G)；弗氏完全佐劑(CFA，sigma 公司，批號：F5881)；LC/MS級乙腈(Merck公司)；高效液相色譜檢測(HPLC)級甲醇(Merck公司)；甲酸(CNW公司)；針灸針(華成牌，蘇州)；LC-Q/TOF-MS儀器分析平臺(Agilent)；C18色譜柱(Agilent公司)。

1.3 造模方法 除正常組外，其余各組分別采用卵蛋白誘導聯合低溫冷凍法建立RA寒證模型〔4〕：實驗正式開始前3 d，用電推剃去家兔背部肩胛骨間及雙后腿膝關節周圍的毛；將4 mg/ml的卵蛋白溶液與等量CFA充分混勻，震蕩成乳化劑，以2%碘酒、75%酒精消毒肩背部均勻選定的6個點，用注射器每點皮下注射該乳化劑0.2 ml；14 d后以相同方式、相同劑量重復皮下注射1次；第二次免疫后6 d，消毒家兔后腿雙膝關節，向關節內分別注入20 mg/ml卵蛋白生理鹽水溶液0.4 ml。在24 h之內膝關節出現紅腫觸痛，表明模型復制成功。在模型復制成功后第2天，用70%酒精消毒兩后腿，上、下、左、右圍置冰袋(3份冰+1份結晶氯化鈣，粉碎混合，溫度降至-20℃～-25℃)冷凍1.5 h，在45℃溫水中復溫5 min(室溫12℃)，共冷凍1次。冷凍后14 d，家兔表現為精神萎靡不振，兩后肢匍伏，膝關節腫脹、周徑明顯大于正常組，局部青紫、皮溫不高，表示成功建立寒證RA模型。

1.4 針刺方法 寒證RA模型建立成功后第7天，將家兔用改良后兔臺固定，選取“足三里”穴〔5〕。熱補針法操作參照《鄭氏針灸全集》〔6〕：操作者左手拇指緊按穴位，右手持針刺入穴內8～12 mm，針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續捻按5次；針下沉緊后針尖拉著有感應的部位，連續重插輕提5次；拇指再向前連續捻按5次，反復操作1 min，最后使針下沉緊，留針30 min。平補平瀉法、捻轉補法操作均參照《刺法灸法學》〔7〕：平補平瀉法：針刺得氣后，施以前后均勻捻轉，不單向捻轉，指力均勻，角度180°～360°，頻率60～90轉/min，反復操作1 min。捻轉補法：針刺得氣后，在針下得氣處小幅度前后捻轉針體(角度180°～360°，頻率60～90轉/min)，拇指向前左轉時用力重，指力沉重向下；拇指向后右轉還原時用力輕，反復操作1 min。以上各操作每天1次，每次留針30 min，共針刺7 d。

1.5 滑膜樣本的采集 針刺治療結束后，采用空氣栓塞法處死各組家兔，分離雙側膝關節滑膜組織，于凍存管內置于-80℃冰箱保存，備測。

1.6 樣本處理 ①樣本前處理：室溫解凍后，吸取100 μl樣本于1.5 ml EP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例為樣品∶甲醇=1∶4，渦旋30 s，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取200 μl上清，轉入進樣小瓶中待檢測。②色譜條件：分離色譜柱為C18色譜柱。色譜分離條件：柱溫40℃；流速0.35 ml/min；流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；梯度洗脫程序見表1。進樣量為4 μl，自動進樣器溫度4℃。③質譜條件：采用正、負離子模式不同條件進行檢測，為確保質量的準確性和重復性，應用亮氨酸-腦啡肽作為鎖定質量，正離子模式下產生〔M+H〕+離子556.277 1 D，負離子模式下產生〔M-H〕-離子554.261 5 D。

表1 梯度洗脫程序

1.7 統計學方法 運用Mass Profiler軟件對LC/MS數據進行預處理，在Excel2007中進行后期編輯，將最終結果組織為二維數據矩陣，然后將所有數據歸一化到總信號積分。將編輯后的數據矩陣導入SIMCA-P13.0軟件進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

2 結 果

2.1 原始色譜圖的可視化檢查 對所有樣本的總離子流色譜圖(TIC)進行重疊。初步觀察發現儀器的保留時間重現性非常好，儀器穩定，因而提高了儀器分析和數據結果的可靠性。見圖1。

圖1 所有樣本正、負模式下TIC

2.2 PCA 采用PCA觀察樣本整體分布趨勢，各組樣本能夠較好的分離，各針刺組均向正常組回歸，且熱補針法組較其他組尤為明顯。見圖2。

2.3 差異性代謝產物的挖掘及鑒定 見圖3，圖4，表2，表3。為了更好地獲得導致這種差異的代謝物信息，采用OPLS-DA，根據化合物的精確分子量搜索在線數據庫(http://metlin.scripps.edu/)，解析化合物的質譜，對化合物進行結構鑒定。選擇投影變量重要性(VIP)值(閾值>1)并結合t檢驗中的P值(閾值<0.05)，篩選出差異物質進行鑒定，并計算差異物質在每兩組間變化倍數。具體變化倍數的計算方法：每組樣本有8例生物學重復，檢測出的每個樣本中的每種物質的含量利用峰面積歸一化后求得每個物質對應的峰面積值，每組重復中取平均值，進行統計計算，并取以2為底的函數，即為表格中的Fold change值。模型組滑膜組織代謝物變化較正常組主要體現于丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸、鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂、肌酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量降低(P<0.05)；各針刺組較模型組上述代謝物增高(P<0.05)，但各針刺組間差異無統計學意義(P>0.05)，而熱補針法組肌酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸含量明顯高于平補平瀉組和捻轉補法組(P<0.05)。

A.正常組；B.熱補針法組；C.捻轉補法組；D.平補平瀉組；E.模型組；下圖同圖2 各組家兔滑膜組織正、負模式下PCA得分圖

圖4 各組家兔滑膜組織負模式下OPLS-DA得分圖

ViPMasst檢驗名稱FoldchangeViPMasst檢驗名稱Foldchange2.04489.08730.048丙氨酸1.3041)1.513146.14810.014谷氨酰胺3.0993)2.227175.19310.040瓜氨酸23.3591)1.36775.07160.023甘氨酸2.2673)1.522115.13260.008脯氨酸0.7991)1.891147.130760.004谷氨酸5.3053)1.839146.14810.039谷氨酰胺1.0681)1.157379.24190.022鞘氨醇1-磷酸0.9673)1.53075.07160.017甘氨酸2.4091)3.04489.08730.008丙氨酸4.5494)1.711147.130760.044谷氨酸2.8221)1.675175.19310.006瓜氨酸2.2764)1.03989.08730.033丙氨酸2.8492)1.324115.13260.043脯氨酸1.2404)2.042175.19310.045瓜氨酸0.3332)1.345146.14810.009谷氨酰胺0.9474)1.019115.13260.041脯氨酸0.4132)

1)表示正常組與模型組比較，2)表示平補平瀉組與模型組比較，3)表示捻轉補法組與模型組比較，4)表示熱補針法組與模型組比較，5)表示平補平瀉組與熱補針法組比較，6)表示捻轉補法組與熱補針法組比較；下表同

表3 負模式下各組潛在生物標志物

-表示下降

3 討 論

現代醫學認為，RA是以關節滑膜炎為主要病理改變的自身免疫系統疾病，雖然其具體發病機制尚未闡明，但隨著系統生物學技術的發展，研究發現在RA機體內氨基酸、脂質以及葡萄糖代謝等發生了變化〔8〕。本實驗結果發現，RA機體內氨基酸代謝、脂質代謝發生紊亂，與上述研究相符，說明RA的發病機制涉及途徑廣、層次多等復雜的網絡系統。因此，從現代醫學角度考慮，其發病機制與針灸的多靶點、多途徑、多層次以及類似于網絡結構的整體作用特點甚相合拍。

實驗研究顯示丙氨酸、瓜氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺不僅對維持免疫功能起到重要的作用，它們還可作為氧化應激和細胞凋亡的抑制劑〔9〕；甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺三者作為谷胱甘肽(GSH)的重要組成成分，能夠保護生物膜免受自由基的損傷；本次實驗模型組中上述代謝物含量均降低，可能使RA機體抗氧化能力下降而導致過氧化損傷加重、免疫功能低下、自由基傷害加深。磷脂在磷脂酶的作用下水解為溶血磷脂和自由脂肪酸(FFA)，而溶血磷脂可以加重細胞膜的損傷〔10〕。FFA在酰基輔酶A合成酶(CoAS)作用下與溶血磷脂又合成磷脂〔11〕。因此磷脂代謝異常亦可造成細胞膜受損，本實驗模型組中鞘氨醇1-磷酸、溶血卵磷脂含量均降低，造成細胞膜的損傷。肌酸常作為保護細胞膜的代謝物之一，具有調控細胞凋亡的功能〔12〕，模型組中的肌酸水平明顯降低，提示機體內細胞膜的完整性降低、過氧化損傷加重。因此認為，模型組中與細胞膜保護以及免疫功能有關的代謝物含量均降低，導致模型家兔的代謝紊亂，出現細胞膜和自由基的損傷、免疫力下降。針刺治療后，上述代謝物的含量均升高，提示針刺可減慢細胞膜破壞、過氧化損傷，改善機體的免疫功能。

目前眾多研究學者認為炎癥反應是RA發病的核心環節，RA滑液中存在著異常的T、B淋巴細胞和顯著升高的腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素-1、-6、-17以及γ干擾素等促炎細胞因子〔13，14〕，這些因子不僅直接造成RA關節滑膜和組織的破壞，還可通過協同作用使機體出現發熱、促神經素釋放增多以及補體基因表達上調等反應，從而影響RA機體的能量代謝水平，導致能量代謝不足的表現。體內的異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸作為支鏈氨基酸，均參與機體蛋白質的合成以及分解過程，具有提供能量底物調節的作用，可維持機體氮的平衡；谷氨酰胺作為機體儲藏量最多的必需氨基酸，是各組織供給能量的重要氮源以及能量來源〔15〕。模型組中上述代謝物的含量均降低，提示與能量代謝有關的必需氨基酸代謝發生了紊亂。而在針刺干預后各代謝物含量均升高，尤以熱補針法組中各代謝物上升明顯，說明熱補針法能夠調節與RA能量代謝相關的氨基酸代謝，在改善機體氨基酸的供給和減緩負氮平衡方面具有一定的特異性作用。

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〔2016-04-13修回〕

(編輯 袁左鳴)

Metabonomics study on synovial tissues of rheumatoid arthritis cold syndrome rabbit treated with heat-reinforcing needling

YUAN Bo,WANG Jin-Hai,FANG Xiao-Li,etal.

Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Objective To compare the influence of metabolites in synovial tissues of rheumatoid arthritis (RA) cold syndrome rabbits treated with different needling and investigate the specificity mechanisms of heat-reinforcing needling for RA. Methods A total of 40 healthy purple blue rabbits were randomly divided into normal control (NC),model control(MC),reinforcing-reducing needling group (RRN),twirling-reinforcing needling group (TRN) and heat-reinforcing needling group (HRN) (n=8). RA cold syndrome rabbit model was made with ovalbumin and freezing. Except NC and MC,RRN was given acupuncture of reinforcing-reducing needling at Zusanli (ST36),TRN was given acupuncture of twirling-reinforcing needling at Zusanli (ST36),and HRN was administrated acupuncture of heat-reinforcing needling at Zusanli (ST36),once a day and retaining 30 min,for 7 times. Fresh synovial tissues of rabbit knee joints were extracted after the intervention,then liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-Q/TOF-MS) technology was used to evaluate metabolic profiles. All the data were analyzed by principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) by using the SIMCA-P(13.0) software for windows. The results were compared. Results The synovial tissues metabolites concerning alanine,citrulline,proline,glutamine,glycine,glutamic acid,sphingolin1-phosphoric acid,lysoph-osphatidylcholine,creatine,isoleucine,leucine,and valine in MC mainly were decreased compared with NC(P<0.05). The above-mentioned metabolites were increased compared with MC and all acupuncture groups (P<0.05),but the metabolites concerning creatine,isoleucine,leucine,valine in HRN were obviously increased than those of RRN and TRN (P<0.05). Conclusions By adjusting the amino acids metabolism which is associated with RA energy metabolism,heat-reinforcing needling has specific effect on RA by improving supply of amino acids and relieving negative nitrogen balance.

Heat-reinforcing needling;Rheumatoid arthritis;Synovial tissue;Metabonomics;Liquid chromatography-mass spectrometry

國家自然科學基金(81260558)；國家中醫藥管理局甘肅鄭氏針法學術流派傳承工作室項目(2305135901)；甘肅省自然科學基金(1208RJZA185)；蘭州市科技計劃項目(2014-1-247)

杜小正(1973-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事傳統針刺手法對免疫性疾病的基礎和臨床研究。

袁 博(1990-)，男，碩士，主要從事傳統針刺手法對免疫性疾病的基礎和臨床研究。

R593.22

A

1005-9202(2017)04-0800-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.008

1 蘭州大學第二醫院 2 上海聚類生物科技有限公司