整合素β8在惡性黑素瘤細胞增殖及侵襲中的作用

整合素β8在惡性黑素瘤細胞增殖及侵襲中的作用

廖曉容1 高永良2

目的:明確整合素β8(ITGB8)在惡性黑素瘤侵襲轉移中的作用。方法:Transwell侵襲實驗在黑素瘤細胞系A375中獲得侵襲性癌細胞和相對靜止性癌細胞，RT－PCR比較兩者整合素家族的表達。流式分選ITGB8細胞，比較其侵襲能力的差異。使用siRNA敲除技術敲低ITGB8，敲低效率分別為:si1組50%，si2組70%，si3組80%，比較其增殖、侵襲能力的變化。Western bolt檢測細胞周期蛋白、基質金屬蛋白酶及EMT相關分子的表達變化，提取細胞核蛋白比較細胞核內β－catenin的變化。利用TCF4的啟動子報告質粒檢測Wnt/β－catenin信號通路的激活情況。結果:ITGB8在侵襲性癌細胞中高表達，是靜止性癌細胞的5倍(P＜0．01);ITGB8陽性組侵襲細胞數為516±45，陰性組為120±22，差異有顯著性(P＜0．01);與Mock組細胞相比，si2和si3組細胞的增殖速度明顯減弱(P＜0．01)，敲低后細胞阻滯在S期。與Mock細胞相比Cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP7、Ncadherin、Vimentin在si2和si3細胞中的表達明顯減少，Ecadherin明顯增加。si2、si3細胞核內β－catenin相比Mock組明顯減少(P＜0．05)。敲低ITBG8后TCF4的啟動子活性明顯降低。結論:ITGB8對惡性黑素瘤的增殖及侵襲轉移具有重要作用，可能是通過調控Wnt/β－catenin信號通路發揮作用。

惡性黑素瘤;TGB8;Wnt/β－catenin信號通路;侵襲;轉移

惡性黑素瘤是危害人類健康的惡性腫瘤，是女性三大惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、轉移早、死亡率高的特點。侵襲、轉移是惡性黑素瘤的主要特點和致死原因［1］。近年來惡性黑素瘤治療手段不斷改進，但其死亡率依然較高，主要原因就是對其侵襲、轉移的機制認識不清楚。最近研究發現，整合素家族在腫瘤的發生、侵襲、轉移中越來越被關注，并發現整合素β8(integrinβ8，ITGB8)在前列腺癌的發生［2］、肝癌的耐藥［3］、胃癌的淋巴結轉移［4］、乳腺癌的肺轉移［5］等都發揮作用，并且發現ITGB8同ITGB6具有活化TGF－β的作用［6］。但ITGB8在黑素瘤中的作用及其分子機制并不清楚。為此，我們研究了ITGB8在惡性黑素瘤細胞增殖及轉移中的作用，探討ITGB8對黑素瘤細胞生物學行為的影響及可能的機制。

1 材料和方法

1．1 細胞培養、試劑和儀器A375細胞系(ATCC提供)，DMEM培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(以色列Biological Industries公司)，100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素(美國Gibco公司)，胰酶、EDTA(北京索萊寶);ITGB8鼠抗人單克隆抗體(Abcam，ab30436)，RIPA裂解液、SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS－PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白標準品、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、CCK8檢測試劑(碧云天)，硝酸纖維素(NC)膜、化學發光試劑盒(Immun－StarTM WesternCTM Chemiluminescence kit)(美國Biorad公司)。

1．2 siRNA構建及轉染A375細胞siRNA交由吉瑪基因公司合成。siITGB8序列分別為:Mock:ACCCGTTTATGTGTCTCCCGGCAAA，sh1:CATGAAACTTTCAGGTGCAACTTCTsh2:ACCGCTGCATTTGTCTGCCTGCAAAsh3:TGAAGACAATAGATGTGCATCTTCA。

利用LipofectamineTM2000(Thermofisher公司)的轉染試劑進行轉染，將A375細胞消化重懸后取2× 105個鋪于6孔板中，待細胞貼壁后采用無血清的培養基饑餓6 h，配制轉染試劑200μL=10μL LipofectamineTM2000+10μL siRNA+180μL OPTI－MEM。搖晃著加入6孔板中，6 h后換成正常的含血清培養基，48 h后取細胞進行檢測及后續實驗。

1．3 RT－PCR引物由Invitrogen公司合成，稀釋引物前瞬時離心，按照說明書，使用滅菌水將引物稀釋成10 nM的工作液，總RNA提取采用RNAiso。cDNA逆轉錄和PCR采用TakaRa公司的逆轉錄試劑盒及定量PCR試劑盒。

1．4 Western blot取10 cm培養皿細胞1皿用PBS溶液潤洗2次，置于冰上，加入RIPA蛋白裂解液400 μL，用細胞刮反復搔刮細胞，在冰上放置30 min。收集蛋白裂解液至1．5 mL EP管中，15000 r/min 4℃離心15 min。吸取轉移上清蛋白液至新的1．5 mL離心管中。蛋白濃度測定采用Thermo公司BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定，制作標準曲線后，計算蛋白濃度，并將各樣品濃度調為一致。按照比例添加5X SDSPAGE蛋白上樣緩沖液，混勻后100℃煮5 min充分變性蛋白。照上述方法配制好分離膠和濃縮膠，將玻璃板組裝入電泳槽中，加入500 mL電泳液，然后拔出梳子，使用微量加樣器上樣，每孔上樣30μg總蛋白，樣品旁孔加入預染的蛋白marker。電泳至溴酚藍到達膠的底端處時停止電泳，將濾紙和PVDF膜浸泡入配好的膜轉移緩沖液中，將濾紙、PVDF膜及凝膠制作三明治，放入電轉槽中。使用濕轉，設定轉膜電流為恒流150 mA，轉膜時間為90 min。把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。轉膜完畢后，將膜放入準備好的封閉液中(5%脫脂奶粉溶液)，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉1～2 h。取出封閉后的PVDF膜，立即加入稀釋好的一抗，4℃孵育過夜。取出孵育一抗的膜，使用PBST洗滌3次，每次15 min，然后將膜放入稀釋好的二抗溶液中，室溫搖床上緩慢搖動孵育2 h，然后使用PBST洗滌3次，每次15 min。蛋白檢測:使用Thermo公司的顯影液進行蛋白顯影，并照相。

1．5 Transwell侵襲實驗使用無血清的RPMI 1640培養基(預冷至4℃)，等比例稀釋基質膠，吸取10μL稀釋好的基質膠，均勻涂布于Transwell小室上室底部的膜表面，37℃培養箱30 min使基質膠凝固。分別消化Mock、sh1、sh2組細胞并洗滌去除血清后使用無血清RPMI 1640培養基重懸細胞，吸取2×105細胞200μL加入Transwell小室的上室，下室加入500μL 10%FBS的RPMI 1640培養基。培養24 h后，取出培養板，用PBS潤洗小室2次然后用4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min。A染液染色，然后用棉簽輕輕擦去膜上面的細胞，洗凈后隨機選取5個視野照相并計數細胞，進行統計分析。

1．6 CCK8及細胞周期測定按照碧云天公司提供的說明書進行。

1．7 統計學方法使用SPSS 17．0軟件對相關數據進行統計學分析。

2 結果

2．1 Transwell模型分選侵襲差異的兩類細胞如圖1a中模式圖所示，我們利用在A375中獲得侵襲能力具有差異的兩區細胞，利用擦刮和胰酶消化的方法可以得到上下兩群細胞(上群為靜止性癌細胞;下群為侵襲性癌細胞)。利用RT－PCR的方法比較常見的整合素家族分子在上下兩群細胞間的差異(圖1b)，發現整合素β8(ITGB8)表達差異最為顯著(5倍)。在A375中檢測發現正常的A375中12%的細胞是ITGB8陽性細胞，并檢測了分析出來的陰性核陽性細胞ITBG8的表達差異，發現差異具有顯著性，進一步說明分選的效率達到實驗的要求(圖1c)。在分選得到了陰性核及陽性兩群細胞后，分別進行Transwell侵襲實驗，發現ITBG8陽性細胞具有更強的侵襲能力，ITGB8陰性組為(120±22)個，陽性組為(516±45)個，差異有顯著性(圖1d，P＜0．01)，反過來也驗證了ITBG8可以作為侵襲性惡性黑素瘤細胞的標志物。

圖1 1a:用胰酶消化的方法得到靜止性癌細胞和侵襲性癌細胞，1b:用RT－PCR的方法發現ITBG8表達有顯著差異性，1c:用流式分選再次證明ITBG8表達有顯著差異性，1d:用Transwell侵襲實驗，證實ITBG8陽性細胞與陰性細胞侵襲力差異有顯著性

2．2 siRNA下調ITBG8的表達對黑素瘤細胞生物學行為的影響為證明ITGB8對A375細胞侵襲能力的影響，我們利用siRNA技術選擇性的敲低ITBG8的表達，如圖2a所示，通過RT－PCR和Western Blot發現在合成的3個siRNA中，si2和si3的調低可以達到70%以上。利用CCK8實驗，發現下調ITBG8可明顯抑制細胞的增殖能力(圖2b)，細胞周期檢測發現，下調ITBG8可明顯增加S期，而減少G0/G1期(圖2c)。利用下調ITBG8細胞及對照細胞進行Transwell侵襲實驗，同樣發現下調ITGB8后可抑制細胞的侵襲能力，侵襲的細胞數Mock組為(573±57)個，si2組為(210±29)個，si3組為(125±20)個，差異均具有統計學意義(P＜0．01)(圖2d)。

2．3 下調ITBG8后對細胞周期及侵襲轉移相關蛋白的表達Cyclin D1的影響在下調ITBG8的細胞中發現Cyclin D1的表達明顯降低。通過Western Blot發現在下調ITBG8細胞中后si2、MMP9、MMP7、Ncadherin、Vimentin在和si3中明顯降低，Ecadherin在si2和si3中明顯增加(如圖3)。我們利用細胞核提取試劑盒在Mock和si2、si3細胞中得到了細胞核蛋白，通過檢測β－catenin的表達量發現敲低ITGB8后可以明顯減少核內β－catenin的量(圖3a)。進一步我們利用了TCF4的啟動子雙熒光素報告系統，通過轉染TOP、FOP和海參熒光素質粒，24小時后檢測其熒光素值，發現敲低ITBG8后可以明顯降低TCF4的啟動子活性，抑制了Wnt/β－catenin信號通路的活化(圖3b)。

圖2 2a:用RT－PCR和Western Blot發現si2和si3表達下調，RT－PCR的方法發現ITBG8表達有顯著差異性，2b:敲低ITBG8，顯著抑制細胞的增殖能力，2c:用細胞周期試劑盒發現敲低ITBG8，可以明顯增加S期，而減少G0/G1期，2d:敲低細胞和Transwell侵襲實驗同樣證實ITGB8降低，可抑制細胞的侵襲能力，差異有顯著性圖3 3a:通過檢測β－catenin的表達量，發現敲低ITGB8可明顯減少核內β－catenin的量;3b:用TCF4的啟動子雙熒光素報告系統，通過轉染TOP、FOP和海參熒光素質粒，同樣證實敲低ITBG8后可明顯減弱TCF4的啟動子活性

3 討論

整合素是細胞表面受體與細胞外基質相互作用的重要分子，由α和β兩種亞基結合而成，目前發現整合素家族包括了18個α亞基和8個β亞基共同組成24個整合素分子，其配體包括了細胞外基質的主要成分如膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白及骨橋蛋白等。通過調節細胞外基質而影響細胞形狀、細胞遷移能力以及細胞周期變化。整合蛋白自身并不具有激酶結構域或酶活性，其發揮作用主要依靠其他信號分子的作用來傳輸信號［7，8］。目前研究發現整合素家族分子在腫瘤的發生、發展、耐藥治療等都有重要作用［9－11］。有研究發現如果在干細胞表達中缺失整合素會導致細胞分化異常而導致腫瘤的產生［12］。吳殿青的研究發現整合素信號能夠調控中性粒細胞的極性，猜測其在腫瘤免疫中可能也發揮作用［3］。Cordes等［13］確定β1－整合素(β1－integrin)/FAK/皮層肌動蛋白(cortactin)信號傳導途徑在頭頸部鱗狀細胞癌抗放射治療中發揮著關鍵性作用。Moore的研究發現通過αvβ6靶向抗體264RAD可以明顯減少乳腺癌的大小和侵襲，聯合赫賽汀治療則能完全根除小鼠腫瘤［14］。抗整合素ct5131的抗體能抑制神經膠質瘤細胞與ECM的黏附，從而抑制腫瘤細胞生長［15］。

惡性黑素瘤是一種惡性程度極高的腫瘤，目前全球的死亡率為4/5，其惡性程度與其高侵襲高轉移的特性密切相關，臨床上較難早期診斷，發現時病情已經迅速發展。因此能夠闡述其侵襲轉移的機制對其預后的判斷，治療手段的發展都具有重要意義［16－18］。在腫瘤細胞的侵襲轉移過程中，基質金屬蛋白酶和上皮間質轉化(EMT)被認為是其重要的機制和指標分子，腫瘤細胞通過增加基質金屬蛋白酶的表達，不斷破壞周圍的組織結構，同時獲得侵襲的空間。EMT是近年來逐漸被認可的腫瘤侵襲轉移新機制，EMT最初是在胚胎發育的過程中被發現，隨后Wenberge教授將其引入腫瘤的侵襲轉移中，即上皮源性的腫瘤細胞在發生發展中可以通過發生EMT而獲得間葉源性細胞的表型，具有更低的黏附能力，和更強的運動能力，而Ecadherin、Ncadherin、Vimentin被認為是細胞發生EMT重要的指標分子，ITBG8一方面可以通過分泌更多的基質金屬蛋白酶來獲得侵襲空間，另一方面也可以通過EMT來獲得更強運動能力。為了進一步探討ITBG8是通過什么樣的機制來調控細胞周期及侵襲轉移相關蛋白的表達，我們查閱文獻發現與周期及侵襲相關的信號通路是Wnt/β－catenin信號通路，經典的Wnt/β－catenin信號通路是細胞在Wnt蛋白的作用下通過分子間的相互作用引起β－catenin在細胞漿的累積而進入細胞核結合TCF的啟動子區進而引起下游分子的變化，例如Cyclin D1、MMP2、MMP9、MMP7等都是其經典的下游分子。而β－catenin在細胞內還會與Ecadherin相互結合在細胞膜上，Ecadherin的表達降低意味著會有更多的β－catenin得到釋放，而細胞核激活Wnt/β－catenin信號通路。

在本實驗中，我們通過Transwell實驗成功的分離了惡性黑素瘤細胞的兩個亞群，并在此基礎上研究了整合素家族在其中的表達差異，發現ITGB8在兩個亞群中的表達明顯不同，通過Transwell侵襲實驗，我們發現ITBG8陽性細胞具有更強的侵襲能力，ITGB8陰性組為(120±22)個，陽性組為(516±45)個，差異有顯著性，說明ITBG8可能在惡性黑素瘤侵襲轉移中具有重要作用，反過來也驗證了ITBG8可以作為侵襲性惡性黑素瘤細胞的標志物。我們還證實了ITBG8可以影響惡性黑素瘤細胞的細胞周期，利用CCK8實驗，我們發現下調ITBG8可明顯抑制細胞的增殖能力，同時明顯增加S期，并減少G0/G1期，利用下調ITBG8細胞及對照細胞進行Transwell侵襲實驗，同樣發現下調ITGB8后可抑制細胞的侵襲能力。實驗中我們發現敲低ITBG8后可以明顯降低TCF4的啟動子活性，抑制了Wnt/β－catenin信號通路的活化。我們推測其具體的分子調控機制可能和Wnt/β－catenin信號通路的調控有關［19］，利用Wnt/β－catenin信號通路激活判斷標準，我們進一步證明了ITBG8確實是可以通過調控Wnt/β－catenin信號通路進一步調控腫瘤細胞的周期及侵襲轉移能力。

通過本實驗我們認為ITGB8對惡性黑素瘤的增殖及侵襲轉移具有重要作用，可能是通過調控Wnt/β－catenin信號通路發揮作用。然而由于實驗條件的限制，我們的研究仍然不足，如果有能力進行更大范圍的基因及信號通路的篩選，可能會尋找到更有意義的分子，且在ITBG8的作用這方面沒有進行體內實驗，缺少了一個重要證據。但是我們的研究結果仍然給研究人員提供了重要的方向和思路，提示ITBG8在惡性黑素瘤的發生發展中可能起到了關鍵作用。

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(收稿:2016－02－15修回:2016－06－23)

The role of integrinβ8 in the invasion and metastasis of malignant melanoma

LIAOXiaorong1，GAOYongliang2．
1．DepartmentofDermatology，theSixthPeople＇sHospitalofChongqing，Chongqing400060，China;2．DepartmentofDermatology，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China
Correspondingauthor:GAOYongliang，E－mail:gao2418@126．com

Objective:To determine the role of integrinβ8(ITGB8)in the invasion and proliferation of malignant melanoma．Methods:Melanoma cell line A375 cancer cells were divided into invasive cancer cells and non－invasive cancer cells through Transwell invasion experiment．The expression of integrin family in the A375 cancer cells was detected by RT－PCR．The invasive abilities of the A375 cancer cells of ITGB8 negative and positive cells were compared by flow cytometer．The ITGB8 positive A375 cancer cells were knocked out by siRNA knockout technology and the removal efficiency was 50%in si1 group，70%in si2 group and 80% in si3 group．The proliferation and invasion were compared among the three groups．The cellcycle protein molecules，matrix metalloproteinases and EMT related molecule were detected by Western bolt．The nucleus protein was extracted to compare the changes of Wnt/beta－catenin in the nucleus of the A375 cancer cells in different knockout efficiency．The activation of beta－catenin signaling pathway was detected through TCF4 promoter report plasmid(TOP/FOP)test．Results:The expression level of ITGB8 in invasive cancer cells was 5 times as high as in non－invasiveβ8(P＜0．01)．The number of ITGB8 positive invasive cancer cells was 516 ±45，which was higher than that in ITGB8 negative invasive cancer cells(120±22)，with a significant difference(P＜0．01)．The proliferation rate of the cells in si2 group and si3 group was lower than that in MOCK cells．Compared with the cells in MOCK group，the expression of Cyclin D1，MMP2，MMP9，MMP7 and Ncadherin，Vimentin decreased and Ecadherin increased in si2 and si3 groups．The amount of the beta－catenin in cell nucleus in the cells of si2 and si3 group was lower than that in Mock group．Promoter activity of TCF4 decreased after ITBG8 removed．Conclusion:ITGB8 plays an important role in the process of invasionand proliferation of malignant melanoma，which may through regulating the Wnt/beta－catenin signaling pathways．

Malignant melanoma，ITGB8，Wnt/beta－catenin signaling pathway，infect，transfer

1重慶市第六人民醫院皮膚科，重慶，400060 2重慶醫科大學附屬第一醫院皮膚科，400016

高永良，E－mail:gao2418@126．com