貴州薏苡黑穗病的發病情況及其病原菌的分離鑒定

劉榮++申剛

摘要 為有效防治薏苡黑穗病，提高薏苡的質量和產量，通過抽樣調查薏苡黑穗病的發病情況，并采用組織分離法分離得到薏苡黑穗病病原菌，結合形態學描述、ITS序列比對分析該菌。結果表明：薏苡不同品種（系）之間的感病情況存在差異，同一品種在不同區域的耐病性也不盡相同。此外，結合形態特征和分子生物學方法鑒定得到該病原菌為薏苡黑粉菌。

關鍵詞 薏苡黑穗病；發病情況；病原菌；分離鑒定；貴州地區

中圖分類號 S412 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）22-0102-02

Abstract For controlling job′s-tears smut，improving the quality and yield of Coix lacryma-jobi L.，surveyed morbidity of job′s-tears smut，obtained job′s-tears smut by tissue separation，and analyzed the bacteria in combiation with morphological description，ITS sequence alignment.The results showed that occurrence situation of job′s-tears was different among different varieties （or lines） of Coix lacryma-jobi L.，the same varieties in different regions also had different diseased resistance.In addition，we identified the pathogen of job′s-tears was Ustilago coicis Brefeld combined with morphological characteristics with molecular biology methods.

Key words job′s-tears smut；morbidity；pathogenic bacteria；identification；Guizhou Area

薏苡（Coix lacryma-jobi L.），又名藥玉米，屬于禾本科（Poaceae）薏苡屬（Coix）。薏苡作為一種藥食兼用作物，具有豐富的營養價值和藥用價值，被譽為“世界禾本科植物之王”[1]。雖然國發[2012]2號文件已將薏苡列為貴州特色發展的主要作物之一，但是貴州地區常年雨量充沛，時空分布不均，3個多雨區之一位于省之西南部，降雨日數較多，相對濕度較大。而水分是影響薏苡黑粉菌厚垣孢子萌發的主要因素之一[2]。薏苡在種植過程中易感染薏苡黑穗病，嚴重制約著薏苡的產量和品質。薏苡黑穗病是由薏苡黑粉菌（Ustilago coicis Brefeld）引起，病原屬于擔子菌亞門；該病易感染，分布廣，在大多數國家均有報道[3-4]。據1957年、1958年進行的田間調查，發現薏苡黑穗病危害十分嚴重，大田的平均病株率達80%～100%，病癭率達50%以上[5]。隨著薏苡感病雜交種的推廣，連作薏苡的增加，薏苡黑穗病害不斷蔓延、加重，以致薏苡產量喪失嚴重。因此，筆者就貴州地區薏苡同一品種不同生育期以及不同品種間黑穗病進行調查分析，并將薏苡黑穗病病原菌進行分類鑒定，旨在摸清薏苡種植區病情發生情況，為該地區的薏苡黑穗病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 薏苡黑穗病發生情況調查

供試材料為Y83、Y160、Y164，共3個品種（系）；各品種（系）的基本信息如表1所示。

調查時間為2014年5—10月及2015年5—10月；調查地點位于貴州省興義市、興仁縣、貞豐縣、晴隆縣，以主栽區興仁縣為主。選擇歷年薏苡黑穗病發病較重的種植區進行調查。采用對角線5點取樣，每點10株，每個品種4個重復，調查薏苡黑穗病發病率和嚴重度。

1.2 薏苡黑穗病病原菌的分離鑒定

病原菌的分離采用組織分離法及單孢分離法。病原菌的形態鑒定參考《中國真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”描述進行。病原菌的分子鑒定運用通用引物ITSl（5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′）一對引物進行病原菌的ITS（internal transcribed spacer）序列的擴增，連接轉化后對陽性轉化子進行克隆測序；利用軟件DNAStar的MegAlign程序和NCBI上的Blastn程序進行序列比對分析。 儀器與試劑：BX51型顯微鏡（OL-YMPUS）、XD-1型二氧化碳臨界點干燥器（Eiko公司）、IB-3型離子鍍金儀（Eiko公司）、JSM-6390LV掃描電鏡（JEOL公司）；葡萄糖、瓊脂粉、3%戊二醛、乙醇、乙酸異戊脂等。

2 結果與分析

2.1 不同品種（系）薏苡黑穗病發生情況

薏苡黑穗病主要感染薏苡的莖、葉、穗。由表2可知，薏苡在種植過程中感染黑穗病的情況較嚴重，且不同品種（系）之間的感病情況存在差異。從調查的3個品種（系）來看，Y83的病株率較其他2個品種高，Y160的發病率大于Y164的發病率。以調查地點為依據，不同地區的感病性也不盡相同，3個品種抗黑穗病能力在興仁縣均較弱，Y83和Y160在興義市的發病率相對要低些，而Y164在晴隆縣的耐病性較高。從而可以推斷，Y164的抗病能力強于Y160和Y83，而Y83的抗病能力最弱。

2.2 薏苡黑穗病病原菌鑒定

2.2.1 形態鑒定。通過分離得到薏苡黑穗病病原菌后，將其接種到PDA培養基上，28 ℃培養過程中進行菌落形態和顯微形態觀察。圖1為病原菌培養15 d后的菌落形態，可以看出：菌落直徑約為5.82 cm，菌落中央皺褶凸起、邊緣整齊，表面呈白色、反面淡黃色。顯微形態觀察：成熟的黑粉孢子近球形或卵圓形，7.45～11.00 μm×7.5～10.5 μm，有刺。通過掃描電鏡觀察發現：刺間有小疣。以上形態觀察描述與《中國真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”的薏苡黑粉菌的形態特征一致，初步斷定該病原菌為薏苡黑粉菌。

2.2.2 分子鑒定。根據形態鑒定的結果，選取3個典型菌株，并采用CTAB法提取其基因組DNA。以基因組DNA為模板，ITSl和 ITS4為引物進行PCR擴增，獲得約600 bp的片段（圖2），克隆測序后分析顯示：3株菌株的擴增序列一致，將其ITS序列在NCBI（national center for biotechnology information）上進行Blastn（核苷酸序列比對）同源性分析發現：該序列與Ustilago coicis（JX219371.1）的ITS 1 5.8S 核糖體RNA基因相似性最高，達99%（圖3）。進一步證實薏苡病原菌為薏苡黑粉菌。

3 結論與討論

通過對Y83、Y160、Y164 3個品種在不同區域耐黑穗病能力進行調查，結果顯示Y83抗黑穗病能力最弱，Y160次之；同時調查同一品種在不同區域的耐病性，不同地區的感病性也不盡相同，不同品種（系）在興仁縣的發病率都相對較高。由此可以推斷：薏苡不同品種在同一地區感染黑穗病的發生情況存在差異；因貴州地區特殊的氣候條件，薏苡同一品種在不同區域耐黑穗病能力不同。而且黔西南屬于貴州省三大多雨區之一，降雨日數較多，相對濕度較大，這種溫濕度適宜孢子萌發生長。因此，在選擇薏苡種植品種時，不僅要重視薏苡的品質、產量，還要考慮品種的抗病能力。

對分離得到的黑穗病病原菌進行形態和分子的綜合鑒定，觀察得到3個菌株的形態特征和測序結果一致。1940年，Mundkur[6]對植物黑穗病調查研究過程中發現薏苡黑粉菌，并命名為C.lacryma-jobi Mundkur。而Chowdhury[7]提出的觀點與Mundkur存在分歧，他在研究過程中把此菌與Ustilago coicis同義進行報道。后來，Zhang等[8]對該菌的超顯微形態結構和分子系統發育樹進行分析后得出：該菌與Ustilago trichophora親緣關系最近，達84%。但筆者將研究結果同《中國真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”比較以及對序列比對分析，初步斷定該病原菌為薏苡黑粉菌。

4 參考文獻

[1] 楊繼祥.藥用植物栽培學[M].北京：農業出版社，1993：284-292.

[2] 王秀全，傅建國.薏苡黑粉病的防治[J].中藥材，1985（3）：3.

[3] SMALL W.Matter of phytopathological interest during 1926[J].Rev Appl Myco，1927（6）：273-274.

[4] TITATARN S，CHIENGKUL A，UNCHALISANGKAS D，et al.Occurren-ce of Ustilago coicis on Coix lachryma-jobi in Thailand[J].Plant Dis，1983，67（4）：434-435.

[5] 李彥勇，鄭茂源.薏苡黑穗病[J].植物保護，1964（6）：13.

[6] MUNDKUR B B.A second contribution towards a knowledge of Indian Ustilaginales：Fragments xxvi-l.[J].Trans Br Mycol Soc，1940，24（3/4）：312-336.

[7] CHOWDHURY S.Some studies on the smut Ustilago coicis Bref.of Job′s tears millet[J].J.Indian Bot，Soc，1946（25）：123-130.

[8] ZHANG J Z，GUAN P G，TAO G，et al.Ultrastructure and phylogeny of Ustilago coicis[J].Journal of Zhejiang University SCIENCE B，2013，14（4）：336-345.