探討超高效合相色譜技術(shù)測定中藥黃芪中黃酮類化合物的成分

徐敏嫦+陳轉(zhuǎn)艮+梁淑貞+林維茂

【摘要】 目的 探討超高效合相色譜技術(shù)測定中藥黃芪中黃酮類化合物成分的效果。方法 采用超高效合相色譜技術(shù)對中藥黃芪中黃酮類化合物的成分進(jìn)行測定， 選擇色譜柱：Agilent Cu（250.0 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1 ml/min；流動相：甲醛-水梯度洗脫；檢測波長為254 mm；并選擇適宜的溫度。分析結(jié)果。結(jié)果 精密度實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果良好， 且供試品溶液的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好， 其中算出對照品面積的RSD分別為2.5%、1.7%、1.5%、2.2%、1.8%、1.6%。結(jié)論 應(yīng)用超高效合相色譜技術(shù)測定中藥黃芪中黃酮類化合物的成分效果顯著， 操作簡便， 精確度高， 具有較強(qiáng)的可靠性， 是理想的測定中藥黃芪中黃酮類化合物的成分方式， 值得推廣。

【關(guān)鍵詞】 超高效合相色譜技術(shù)；中藥黃芪中黃酮類；化合物；成分

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.04.095

中藥黃芪中黃酮類化合物的成分主要包括防風(fēng)、黃氏、白術(shù)， 這些中藥均為臨床上治療反復(fù)上呼吸道感染的經(jīng)典藥方， 其具有很好是免疫調(diào)節(jié)作用。目前， 有研究表明藥理學(xué)中的黃芪中黃酮類化合物成分可大大降低患者大腦動脈栓塞率， 而且還能有效增加缺血組織抗癢化酶的水平。本文作者經(jīng)過建立一組超高效合相色譜技術(shù)對中藥黃芪中黃酮類化合物的成分進(jìn)行檢測定， 現(xiàn)將具體內(nèi)容報告如下。

1 儀器與材料

1. 1 儀器 采用Agilent1200高效的液相儀， 系列四元梯度汞、自動進(jìn)樣器， 并選擇二極管陣列檢測器， 便于檢測DAD， 然后選擇天津四友化學(xué)試劑公司生產(chǎn)的甲醇試劑；中國藥品生物制品檢定所制造的黃氏甲苷對照品試劑；雙蒸水；超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司， KQ-400KDE）；電子分析天平（Mettler公司， AB135-S）。

1. 2 材料 色譜純包括甲醇、乙腈、異丙醇， 而水為超純水， 對照品槲皮素、芒柄花素、山奈酚、芒柄花苷都是來自于中國藥品生物制品檢定所。甘肅和陜西產(chǎn)的膜莢黃氏的干燥根， 還有中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所教授鑒定內(nèi)蒙古產(chǎn)為豆科植物蒙古黃氏的干燥根， 毛蕊異黃酮苷是購自于北京恒元啟天化工技術(shù)研究院， 而且純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般>98%。

2 方法與結(jié)果

2. 1 精密度實(shí)驗(yàn) 選取混合對照品儲備液， 根據(jù)色譜的條件進(jìn)行重復(fù)性是進(jìn)樣約6次， 然后分別計算毛蕊異黃酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花峰的面積， 且每次進(jìn)樣2 μl測定， 結(jié)果表明此方法的精密度檢驗(yàn)較好， 毛蕊異黃酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花峰的面積分別為1.63%、1.74%、1.45%、1.50%、0.98%、1.26%。

2. 2 色譜的條件 色譜柱Agilent Cu（250.0 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速為1 ml/min， 進(jìn)樣量為2 μl；流動相A為甲醛水0.1%， 流動相B為7∶3的甲酸乙腈-異丙醇梯度洗脫0.1%；檢測波長為254 mm；柱溫約為30℃。

2. 3 對照組品溶液與供試品溶液的制備 分別給予對照品毛蕊異黃酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花峰精密稱取1.3、1.5、1.4、1.5、1.4、1.4 mg， 然后放置于1 ml的量瓶中， 再加入甲醛到刻度尺寸高度， 且搖勻使其混合， 接著配制成混合性的對照品儲備液。對于供試品溶液的制備， 首先選取大約2.0 g的藥材粉末， 同樣精密稱定， 然后放置于具塞錐形瓶里， 再加入25 ml的甲醇， 并冷制溫室中保存， 超聲40 min。當(dāng)過濾到25 ml量的瓶子中時， 可適當(dāng)加入甲醇到規(guī)定的刻度， 經(jīng)過0.22 μm的微孔慮膜過濾， 隨后搖勻， 最后再次取續(xù)濾液， 即可完成供試品溶液的制備。

2. 4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 在操作穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的過程中， 應(yīng)按照供試品溶液的制備， 在溫室下測定0、2、4、6、8、12、24 h供試品溶液的穩(wěn)定性情況。然后以峰面積為指標(biāo)對毛蕊異黃酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素的RSD進(jìn)行測定， 結(jié)果測得出以上對照品的RSD分別為2.3%、1.7%、1.6%、1.5%、1.9%、2.1%， 以上數(shù)據(jù)充分說明了供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2. 5 重復(fù)性考察 針對供試品溶液的制備進(jìn)行考察， 首先選取2.0 g的黃氏粉末， 同樣按照供試品溶液的制備然后平行制備6份的供試品溶液， 并在色譜條件下分析其考察效果。然后計算出毛蕊異黃酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花峰面積的RSD， 結(jié)果計算出其面積RSD分別為2.5%、1.7%、1.5%、2.2%、1.8%、1.6%， 以上數(shù)據(jù)表明了供試品溶液的重復(fù)性良好。

3 討論

近年來， 對于黃酮類成分含量測定方面的報道相對較多， 一般常見的為高效液相色譜法、薄層色譜法以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等， 而液相色譜質(zhì)譜法， 采用的儀器價格比較昂貴[1-6]， 一般在國內(nèi)還沒有被普遍使用；層析色譜與高效液相色譜法的特異性基本一樣， 其干擾物質(zhì)比較多， 而且定量不準(zhǔn)確， 分析的時間液比較長， 不能夠同時測定多種物質(zhì)[2， 7]。高效液相色譜法能夠通過精確調(diào)節(jié)流動相強(qiáng)度、壓力和溫度， 并且在整個分離過程中具有較好的重復(fù)性[3]。不僅如此， 高效液相色譜法還具有較高的線速度和較低的密度， 其在分離過程中具有很高的柱效， 分析速度快， 靈敏度高， 有機(jī)溶劑使用量極少[4]。與氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法相比， 其具有較高的溶解能力， 比較適用于分離難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定性物質(zhì)， 但是并不適合于難揮發(fā)及熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分離[5]。

本研究采用超高效合相色譜法同時測定黃芪中的幾種主要黃酮類化合物， 實(shí)驗(yàn)表明， 本方法靈敏度高、操作快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好、實(shí)用性強(qiáng)， 是一種新型的分析儀器， 可為黃酮類化合物的定性與定量檢測提供了廣泛的選擇性， 也是一種高效可行的色譜檢測方法。本次實(shí)驗(yàn)采用的是采用超高效合相色譜法對毛蕊異黃酮苷、槲皮素、山奈酚、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素進(jìn)行測定， 其中甘肅的毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷含量比陜西的高。而內(nèi)蒙古黃芪的干燥根具有味甘， 性溫， 歸肺、脾經(jīng)的效果；且具有補(bǔ)氣固表、斂瘡生肌的作用。在臨床上適用于氣虛水腫、氣虛乏力、表虛自汗、慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等癥。該方法的精密度、重復(fù)性以及考察的結(jié)果比較穩(wěn)定， 而且可靠。有研究表明[6]， 黃酮類成分作為其有效成分之一， 它不僅具有降血脂、抗菌抗病毒、抗氧自由基的作用， 而且還具有抗缺血， 以及改善血象的作用。

綜上所述， 應(yīng)用超高效合相色譜技術(shù)測定中藥黃芪中黃酮類化合物的成分效果令人十分滿意， 不但操作簡便， 精確度高， 而且具有較高的可行性， 值得在臨床中廣泛推行。

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