黃瓜 CsHIR1基因表達載體的構建及遺傳轉化

任丹莉，陳菲帆，王 暉，秦亞光，張 顏，李玉紅

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

黃瓜 CsHIR1基因表達載體的構建及遺傳轉化

任丹莉，陳菲帆，王 暉，秦亞光，張 顏，李玉紅

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100)

為了優化黃瓜遺傳轉化體系以及研究 CsHIR1基因在黃瓜中的功能特性，本試驗利用In-fusion技術構建植物表達載體pCAMBIA35S- CsHIR1，經過限制性內切酶SalⅠ和BamHⅠ雙酶切檢測、質粒PCR檢測和測序鑒定，結果表明，表達載體pCAMBIA35S- CsHIR1已構建成功并轉入農桿菌GV3101中。以黃瓜抗病種質‘PI197088’和感病種質‘CCMC’的子葉節為外植體，通過優化的農桿菌介導法初步將 CsHIR1基因轉入黃瓜中，經PCR檢測獲得25株陽性植株，其中8株陽性植株自交得到種子T1代，T1代PCR檢測陽性率為44.7%，實時熒光定量分析表明 CsHIR1在T1代陽性株中的相對表達量稍高于對照植株，有1株與對照組的差異較顯著，這為進一步研究 CsHIR1在黃瓜中的功能奠定了基礎。

黃瓜； CsHIR1；表達載體；遺傳轉化

霜霉病是黃瓜(CucumissativusL.)生產上最重要的卵菌病害之一，嚴重影響黃瓜的產量和品質[1-4]。噴施殺菌劑是目前生產上最主要的防治方法，但會導致環境污染、農藥殘留及使病原菌產生抗藥性等一系列問題[1-3]，而抗病品種的培育是防治黃瓜霜霉病最為經濟有效的措施。挖掘新的抗性相關基因，解析其抗性機制，是培育黃瓜抗霜霉病新品種的基礎和前提。由于黃瓜的遺傳基礎極為狹窄，而霜霉病的抗性又是由多基因控制的數量性狀，因此，創制新的抗性種質資源，可以加速黃瓜抗性分子育種的速度。

遺傳轉化是驗證克隆基因功能最為直接和重要的方法之一[5]，也是創建新種質改善植物性能最有效的方法之一。目前，已用于轉基因研究的植物有200多種，而農桿菌介導法是最常用的轉化方法[6]。受基因型、外植體類型、激素、培養基等多種因素的影響，瓜類植物如西甜瓜、黃瓜、苦瓜等遺傳轉化都比較困難[7]。黃瓜的遺傳轉化雖起步較早，但目前仍然沒有建立起高效穩定的黃瓜遺傳轉化體系,因此，這已成為國內外學者亟需解決的問題。

過敏性誘導反應(Hypersensitive induced reaction，HR)，是寄主抵抗活體寄生病原菌侵染的最有效防御機制之一，植物細胞HR可以有效防止病原菌向植株其他健康部位侵染和擴展[8-11],與HR反應有關的過敏性誘導反應蛋白(Hypersensitive-induced response protein, HIRP)，在植物對抗病原物的過程中起到重要作用[12-15]。目前,已經在煙草[7]、玉米[16]、大麥[17]、辣椒[18]、水稻[15]、小麥[19]、花生[20]等栽培作物上克隆到HIR基因，并證明HIR基因的表達涉及HR反應[13-20]。但對HIR蛋白的功能研究較少，僅在辣椒、小麥和水稻上有所涉及[21]。西北農林科技大學黃瓜課題組對黃瓜抗/感種質接種霜霉病菌后的 CsHIR1基因表達做了研究，發現在抗病種質‘PI197088’的 CsHIR1表達量是感病種質‘CCMC’的3～7倍。為探討 CsHIR1基因在黃瓜霜霉病抗性中的作用，本研究構建 CsHIR1的植物表達載體pCAMBIA35S- CsHIR1，并運用改進的農桿菌介導的遺傳轉化法對黃瓜進行遺傳轉化，為進一步研究 CsHIR1基因在黃瓜霜霉病抗性中的作用以及創制抗霜霉病的新種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

黃瓜高抗霜霉病種質‘PI197088’由美國威斯康星大學麥迪遜分校瓜類研究室提供，黃瓜易感病種質‘CCMC’購于黑龍江省鑫星農業發展有限公司。

1.2 菌種和質粒

載體pCAMBIA35S(含卡那霉素和潮霉素B抗性)由陜西省油菜中心張彥峰先生贈與，大腸桿菌感受態受體菌株 Top10以及根癌農桿菌感受態受體菌株GV3101均由西北農林科技大學園藝學院蔬菜生理生態與生物技術實驗室保存。

1.3 主要試劑

熒光定量試劑盒購于Takara，反轉錄試劑盒和HiProof DNA聚合酶均購自楊凌杰一生物技術有限公司，DNA標準分子質量(2 kb)購自廣州東盛生物科技有限公司，柱式植物 RNA 提取試劑盒、質粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒均購自北京天根公司，限制性內切酶SalⅠ和BamHⅠ購自Fermentas公司，一步克隆試劑盒NovoRec和2×Taqmix購自上海近岸科技有限公司。引物的合成和序列測定工作，均委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.4 試驗方法

1.4.1 黃瓜葉片總RNA的提取及反轉錄 以黃瓜種質‘CCMC’和‘PI197088’的幼苗期新鮮葉片為材料，參照天根生化科技(北京)有限公司的植物RNA提取試劑盒說明書提取黃瓜葉片總RNA，反轉錄用楊凌杰一生物技術有限公司的反轉錄試劑盒進行。用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的質量，并用美國NanoDrop ND-2000C紫外可見光分光光度計檢測提取的黃瓜RNA和cDNA濃度。

1.4.2 植物表達載體的構建 基于In-fusion技術的PCR引物設計原則，運用Primer Premier 5軟件設計引物，CsHIR1-P-L:5′-CGGTAC- CCGGGGATCCATGGGTAATCTTTTTTGTTGTGTGA-3′，劃線處為載體的同源序列，斜體部分為BamHⅠ的酶切位點，CsHIR1-P-R: 5′-TCACCATGGTGTCGACCTAGTGAGAAGT- A GCGGCACCCTGA-3′，劃線處為載體的同源序列，斜體部分為SalⅠ的酶切位點。利用此引物對黃瓜cDNA進行擴增得到 CsHIR1基因。

CsHIR1的PCR擴增體系和載體的連接參照陳菲帆等[22]的方法，擴增程序為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸8 min。用限制性內切酶SalⅠ和BamHⅠ對載體pCAMBIA35S進行雙酶切，酶切體系：模板(100 ng/μL)3 μL，10×tangobuffer 2 μL，SalⅠ(10 U/μL)0.5 μL，BamHⅠ(10 U/μL)0.5 μL，加水至10 μL，37 ℃過夜。酶切產物用10 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳，按照膠回收試劑盒的步驟回收約1 300 bp 的單一線性載體片段。將線性載體片段和擴增的 CsHIR1利用In-fusion技術[22]進行連接組成重組質粒pCAMBIA35S- CsHIR1。

1.4.3 轉化大腸桿菌 用凍融法將重組質粒pCAMBIA35S- CsHIR1轉入感受態大腸桿菌Top10，經卡那霉素(50 mg/L)平板篩選后，挑取單克隆，搖菌提質粒。對重組質粒用限制性內切酶SalⅠ和BamHⅠ進行雙酶切驗證，并利用 CsHIR1-P的擴增引物對重組質粒進行質粒PCR檢測，將通過雙酶切和質粒PCR檢測證實連接正確的載體，送去測序進行進一步驗證。

1.4.4 轉化農桿菌 通過凍融法將測序正確的表達載體pCAMBIA35S- CsHIR1，轉入根癌農桿菌GV3101，利福平(50 mg/L)和卡那霉素(50 mg/L)抗性篩選陽性單克隆后挑菌進行大量擴繁。提取農桿菌質粒進行質粒PCR驗證，并于-80 ℃保存帶有目的載體的根癌農桿菌GV3101。

1.4.5 黃瓜 CsHIR1遺傳轉化 將構建好的植物表達載體分別轉入黃瓜感病種質‘CCMC’和抗病種質‘PI197088’的子葉節，黃瓜的再生體系參照鐘輝麗等[1]的方法，黃瓜的遺傳轉化體系參照李月等[23]的方法，并做相應的改進。如為了提高再生芽的成活率，本試驗并未對其進行抗生素(卡那霉素和潮霉素B)篩選，而是待再生苗成活后統一用潮霉素B引物進行PCR檢測。另外，為了提高轉化效率，本試驗的轉化體系中沒有預培養階段，得到的外植體不經預培養直接進行農桿菌侵染。

1.4.6 轉化植株的PCR鑒定 取移栽成活的再生苗葉片用CTAB法提取DNA，以潮霉素B引物進行PCR檢測來間接判斷載體的轉入情況。檢測后的陽性植株移栽到溫室里，開花后進行自交授粉，得到T1代后取部分種子繼續用潮霉素B引物進行PCR檢測。

1.4.7 轉化植株的實時熒光定量分析 對PCR檢測為陽性的T1代植株，采集葉片參照天根生化科技(北京)有限公司的植物RNA提取試劑盒說明書提取黃瓜葉片總RNA，用反轉錄試劑盒進行反轉錄，得到cDNA置于-20 ℃備用。

用熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaqTM(Perfect Real Time，TaKaRa)對轉基因T1代黃瓜的 CsHIR1進行定量分析，所用儀器為Cfx Connect型定量PCR儀，內參基因用UBI。反應體系為：SYBR Premix ExTaqTM10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加ddH2O至20 μL，每個樣品重復3次。反應條件為預變性95 ℃ 30 s；30個循環，95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s(參考TaKaRa操作手冊)。

2 結果與分析

2.1 黃瓜 CsHIR1表達載體的檢測

對重組質粒pCAMBIA35S- CsHIR1用限制性內切酶SalⅠ和BamHⅠ進行雙酶切分別得到890 bp的 CsHIR1和1 300 bp的載體片段，并以重組質粒pCAMBIA35S- CsHIR1為模板，以 CsHIR1-P為引物，利用HiProof高保真酶擴增目的基因 CsHIR1，進行質粒PCR檢測。雙酶切和質粒PCR的凝膠(10 g/L瓊脂糖)電泳檢測結果顯示，表達載體pCAMBIA35S- CsHIR1初步構建成功(圖1)。然后再將重組質粒pCAMBIA35S- CsHIR1送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，測序比對結果顯示載體pCAMBIA35S- CsHIR1構建成功。

2.2 黃瓜的遺傳轉化

采用優化的農桿菌介導的遺傳轉化體系，具體的培養基配方和培養條件見表1。在此遺傳轉化體系中，沒有預培養階段，切好的子葉節直接進行農桿菌侵染。侵染液中農桿菌的OD600為0.2，即用侵染液將對數期的菌液稀釋3～4倍再進行侵染，侵染液中農桿菌濃度過高易造成污染，過低則轉化效率低。生根培養時，未對再生苗進行抗生素(卡那霉素和潮霉素B)篩選，最后移栽成活的再生苗統一用潮霉素B引物進行PCR檢測。

M.DL2000 DNA ladder；1.質粒雙酶切 Double digested plasmid；2～4.質粒PCR Plasmid PCR；箭頭表示基因 CsHIR1(890 bp)和載體片段 (1 300 bp) Arrows indicate the amplification of the CsHIR1(890 bp) and carrier segment(1 300 bp)

圖1 pCAMBIA35S- CsHIR1重組質粒的檢測
Fig.1 The detection of recombinant plasmids pCAMBIA35S- CsHIR1

表1 黃瓜遺傳轉化體系Table 1 The system of cucumber genetic transformation

經過種子培養，切取子葉節，制備農桿菌，農桿菌侵染和共培養，外植體再生培養，再生苗生根培養，再生苗的馴化，得到T0代轉化植株，將其移栽到大田里進行自交授粉獲得T1代(圖2)。

2.3 黃瓜 CsHIR1轉基因植株的檢測

2.3.1 轉基因植株的PCR檢測 對T0代和T1代的轉化植株均用潮霉素B基因(1 090 bp)進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，T0代獲得18株‘CCMC’和6株‘PI197088’共25個陽性植株，T0代陽性率最高可達17.3%(圖3)，其中8株(6株‘CCMC’和2株‘PI197088’)陽性株得到自交種子T1代，T1代陽性率為44.7%(圖3)。

A.半出殼的種子 Semi-hatched seeds； B.共培養的外植體 Co-cultured explants；C.再生培養的外植體 Explants in regeneration training period；D.出芽的外植體 Budding explant；E.再生苗 Regeneration plant；F.轉基因植株 Transgenic plant；G.已結瓜的轉基因植株 Transgenic plants with fruits

圖2 黃瓜的遺傳轉化過程
Fig.2 The process of cucumber genetic transformation

M.DL2000 DNA ladder；P.含目的基因的重組質粒 The plasmid carrying CsHIR1 gene ；N.未轉化的植株 The normal plant；1～19.部分T0代轉化株 Some transformants from T0 generation；20～32.部分T1代植株 Some transformants from T1 generation；箭頭表示擴增的潮霉素B基因 The arrow indicates the amplification of the Hyg gene

圖3 T0和T1代轉化株的PCR檢測
Fig.3 The PCR detection of T0 and T1 generation transformant

2.3.2 轉基因植株的實時熒光定量檢測 對PCR檢測為陽性的T1代，用實時熒光定量法分析基因 CsHIR1的表達情況，結果表明各T1代之間的 CsHIR1表達差異不是很明顯(圖4)，T1代轉基因植株C1～C5和P1～P2的 CsHIR1表達量與各自的對照CK1、CK2無顯著差異，只有轉基因植株C6與其對照CK1有著顯著性差異(P<0.05)。

3 討 論

本研究以 CsHIR1基因為研究對象，成功構建植物表達載體pCAMBIA35S- CsHIR1，并初步實現 CsHIR1在黃瓜中的遺傳轉化，獲得轉基因T0代和T1代的陽性植株，經統計計算不同批次T0代的轉化率為0～17.3%，其中6株‘CCMC’和2株‘PI197088’的轉化株得到了轉基因T1代。

CK1.CCMC；CK2.PI197088；C1～C6.轉基因CCMC的T1代 T1 generation transformant of CCMC；P1、P2.轉基因PI197088的T1代 P1、P2 T1 generation transformant of PI197088； 柱上不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different letters in column indicate significant difference(P<0.05).

圖4 CsHIR1在不同轉基因植株的T1代葉片中的相對表達量
Fig.4 The relative expression pattern of CsHIR1 in the leaves of different T1 generation transformant

鑒于目前黃瓜的遺傳轉化效率較低，國內外學者主要從外植體的基因型、外植體的種類、生長調節劑、農桿菌種類、侵染條件等方面做了研究[24]。本試驗選用2種基因型的外植體‘PI197088’和‘CCMC’，結果表明，這2種外植體的轉化率基本相同。在種子培養時間上，研究發現4～5 d苗齡的子葉節的再生率和轉化效率較高，這與劉培培等[25]的研究結果相同；在外植體培養條件上，試驗結果顯示再生培養前(種子培養、外植體侵染農桿菌和共培養)使外植體一直保持在黑暗條件下，可以提高黃瓜的轉化效率，這與王燁等[26]認為一定時間的暗培養可以提高外植體的再生率這一結果相似，有研究認為暗處理可以減少外植體溢出酚類物質，從而有利于不定芽的形成進而提高再生率[27]。在再生苗的檢測上，本實驗室對是否加抗生素進行篩選做了比較，發現抗生素篩選會降低黃瓜的轉化效率和阻礙再生苗的生長,抗生素篩選的植株生長勢弱，須根浮于培養基表面，這與王學斌等[28]報道的一定濃度的抗生素篩選可以提高轉化效率不同，造成這種不同的原因可能是不同基因型外植體對抗生素的耐受力不同；在預培養時間上，切好的子葉節不經預培養直接侵染農桿菌轉化效率與經過1～2 d預培養后侵染農桿菌的轉化效率相近，這與王艷蓉等[29]報道的預培養可以提高抗性芽率不同，可能是由于本試驗所用轉化條件以及外植體基因型與前人有所不同，其中1株‘CCMC’的轉基因T1代與對照組有顯著性差異，證明目標基因已經轉化并實現了轉錄水平的表達[30]。

本研究通過優化部分條件建立適合外植體‘PI197088’和‘CCMC’的遺傳轉化體系，并且得到轉基因T1代，初步證明目的基因轉入黃瓜中。后續工作本課題組將會圍繞 CsHIR1的轉化植株進行進一步的檢測和功能驗證，以期獲得抗霜霉病的黃瓜新種質。

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(責任編輯：潘學燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Construction of Expression Vector of Defense Genes CsHIR1 from Cucumber and Its Genetic Transformation Research

REN Danli, CHEN Feifan, WANG Hui,QIN Yaguang,ZHANG Yan and LI Yuhong

(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

In order to study the genetic CsHIR1 features and optimize the cucumber genetic transformation system, CsHIR1 was studied to transform into cucumber plants.The plant expression vector pCAMBIA35S- CsHIR1 was constructed by In-fusion technology.After double enzymesSalⅠ andBamHⅠ digestion detection, plasmid PCR detection and sequence identification, the results showed that expression vector pCAMBIA35S- CsHIR1 has been successfully built and transferred into agrobacterium GV3101.Using the cotyledon node of cucumber germplasm ‘CCMC’of susceptible to downy mildew and high-resistant germplasm‘PI197088’as explant, CsHIR1 gene has been initially proved to transfer into cucumber through the optimization of agrobacterium-mediated genetic transformation system.The 25 positive plants have been obtained by PCR detection, and 8 of which got T1 seeds.The PCR detection positive rate from the T1 generation was 44.7%.We examined the expression of CsHIR1 by real time quantitative PCR in seedlings of T1 generation,one of the six lines was higher than CK indicating the CsHIR1 has been transformed into cucumber.

Cucumber； CsHIR1 gene； Expression vector； Genetic transformation

REN Danli, female, master student.Research area:vegetable breeding and biotechnology.E-mail:1617814061@qq.com

ZHANG Yan,male,Ph.D,lecturer.Research area:germplasm resources and biotechnology in fruit vegetable.E-mail:zhangyan2014@nwsuaf.edu.cn

日期：2016-12-29

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1008.028.html

2016-03-20

2016-05-20

國家自然科學基金(31171955，31471891)；西北農林科技大學優秀人才科研專項資金(QN2009011)。

任丹莉，女，在讀碩士，研究方向為蔬菜育種與生物技術。E-mail：1617814061@qq.com

張 顏，男，博士，講師，主要從事果菜類種質資源與生物技術研究。E-mail：zhangyan2014@nwsuaf.edu.cn 李玉紅，女，博士，教授，主要從事黃瓜種質資源與生物技術研究。E-mail：liyuhong73@126.com

S642.2；Q78

A

1004-1389(2017)02-0255-07

Received 2016-03-20 Returned 2016-05-20

Foundation item National Natural Science Foundation of China (No.31171955,No.31471891); Northwest Agriculture and Forestry University of Science and Technology Research and Special Talents Funded Projects(No.QN2009011).

LI Yuhong, female, Ph.D,professor.Research area:germplasm resources and biotechnology in cucumber.E-mail: liyuhong73@126.com