Hi5-SF懸浮細胞系的建立及鑒定

馬 偉，王家敏，馬桂蘭，馬 祺，馬 花，喬自林，馬忠仁，馮玉萍

(1.西北民族大學 甘肅省動物細胞工程技術研究中心，蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術有限公司，蘭州 730010；3.西北民族大學 生物工程與技術國家民委重點實驗室，蘭州 730030)

Hi5-SF懸浮細胞系的建立及鑒定

馬 偉1，王家敏1，馬桂蘭2，馬 祺2，馬 花1，喬自林1，馬忠仁3，馮玉萍3

(1.西北民族大學 甘肅省動物細胞工程技術研究中心，蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術有限公司，蘭州 730010；3.西北民族大學 生物工程與技術國家民委重點實驗室，蘭州 730030)

從中國典型培養物保藏中心(CCTCC)引進High Five細胞并對其進行馴化，獲得無血清懸浮馴化株(Hi5-SF)。依據《中華人民共和國藥典(2010年版三部)》對其進行細胞生物學特性研究、微生物污染、病毒外源因子及細胞致瘤性檢測。結果發現，Hi5-SF細胞復蘇活力76.3%，生長曲線呈“S”型，最大增殖密度可達3.50×106mL-1，群體倍增時間為26.2 h；細菌、真菌及支原體檢查均為陰性；血細胞吸附試驗、致細胞病變試驗和特異性病毒熒光抗體結合物檢查結果均為陰性；致瘤性檢查結果也為陰性。說明該細胞株符合獸用疫苗生產用細胞質量要求，可以在疫苗研究與生產中應用。

High five細胞；懸浮培養；質量評價

粉紋夜蛾(Trichoplusiani)卵巢細胞株BTI-TN-5B1-4是20世紀90年代Robert R和李國勛等從粉紋夜蛾卵巢細胞系BTI-TN-5B1克隆得到的新型宿主細胞，Invitrogen公司注冊商標為High Five細胞[1-2]。西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術研究中心的High Five細胞引自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，為淋巴母細胞樣形態，半貼壁生長，培養液為Grace’s Insect Medium(含φ=10%的FBS)。High Five細胞對多種病毒敏感并能支持外源基因高效表達，尤其具有較高的多角體病毒增殖能力和重組蛋白表達水平，是當前應用昆蟲桿狀病毒表達載體系統(Baculovirus expression vector system,BEVS)生產病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗的主要細胞系[3-5]。該細胞可在HyQ SFX-Insect、EX-CELLTM405和Express FiveTMSFM等培養基中無血清懸浮培養，然而上述進口培養基價格昂貴，實際生產中并不適用。貼壁生長的High Five細胞需要進行較長時間的懸浮適應培養才能夠在上述商品化無血清培養基正常生長，即使已經適應在某種培養基中懸浮生長，當更換培養基時，細胞仍需要3～5代的適應培養方可正常生長[3]。High Five細胞的高密度無血清懸浮培養在疫苗研究和生產上具有重要意義。本研究利用蘭州百靈生物技術有限公司開發的BFLM502 SFM培養基對引進的High Five細胞(CCTCC株)進行無血清懸浮馴化，獲得可無血清懸浮生長的Hi5-SF細胞株，并對其進行細胞生物學特性研究和質量檢測，以評價該懸浮細胞株用于動物疫苗研究和生產的可能性。

1 材料與方法

1.1 材 料

High Five細胞(CCTCC)；新生牛血清(NBS，蘭州民海)、胰蛋白酶液(Gibco)及無血清培養基(SFLM502 SFM，蘭州百靈)；無菌檢查與支原體檢查培養基(北京三藥科技)、Heochst33258(Sigma)；腦心肌炎病毒VR-739株、牛腺病毒3型WBR-1株、牛腺病毒5型、牛細小病毒Haden株、牛副流感病毒3型SB株和呼腸孤病毒Abney株(ATCC)以及牛病毒性腹瀉病毒Oregon C24V株(中國獸醫藥品監察所)；腦心肌炎病毒、牛腺病毒3型、牛腺病毒5型、牛細小病毒、牛副流感病毒3型、呼腸孤病毒和牛病毒性腹瀉病毒熒光抗體結合物(VMRD)；Vero細胞、MRC-5細胞、ST細胞、牛腎原代細胞和Hela細胞均為甘肅省動物細胞工程技術研究中心保存；SPF級BALB/c Nude 裸鼠(北京維通利華)等。

3111型CO2培養箱(Thermo)、CKX41型倒置相差顯微鏡、IX71型熒光倒置差相顯微鏡(Olympus)、ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器(上海智城)，等。

1.2 方 法

1.2.1 High Five細胞懸浮馴化 選取狀態良好的High Five貼壁細胞，在細胞培養瓶中擴增培養，培養液為BFLM502(含φ=10%的NBS)。待細胞鋪滿單層后用吸管輕輕吹打，收集細胞懸液離心，用新鮮培養液懸浮以50×104mL-1接種到三角搖瓶中，27 ℃、60 r/min懸浮培養，至細胞密度達100×104mL-1以上時離心并收集細胞，按1∶2傳代并提高轉速至80 r/min，同法至轉速提高為120 r/min，穩定傳3代后凍存，并命名為Hi5-S。

1.2.2 High Five懸浮細胞無血清馴化 將懸浮馴化后的Hi5-S細胞，采用逐步降血清法進行無血清培養馴化。血清由φ=10%逐步降至φ=5%、φ=3%、φ=1.5%和φ=0%。無血清穩定培養5代后建庫凍存，并命名為Hi5-SF[6]，凍存液為BFLM502(φ=70%)+NBS(φ=20%)+DMSO(φ=10%)。

1.2.3 Hi5-SF細胞鑒定 復蘇及活力檢查：采用常規方法于27 ℃水浴復蘇細胞，在10 mL BFLM502培養基中懸浮細胞后1 000 r/min離心10 min，換新鮮BFLM502培養基懸浮培養，同時抽樣，臺盼藍染色檢測復蘇活力[7]。細胞培養過程中不定時進行顯微觀察并采集圖像。

生長特性：取狀態良好的Hi5-SF細胞，臺盼藍染色計數，以活細胞密度50×104mL-1接種細胞于三角瓶中，培養體積40 mL，平行3組。27 ℃、120 r/min懸浮培養，每24 h取樣1 mL 計數，直至活細胞密度降低，繪制細胞生長曲線并求出細胞最大增殖密度和倍增時間[8]。

微生物污染檢查和病毒檢查：按照《中華人民共和國藥典(2010年版三部)》進行[9]。

致瘤性檢查：按照《中華人民共和國藥典(2010年版三部)》進行檢查。陽性對照組為5×106mL-1的Hela細胞懸液，陰性對照組為5×107mL-1的MRC-5細胞懸液，待檢組為5×107mL-1的Hi5-SF細胞懸液，注射劑量為每只0.2 mL，每組10 只裸鼠。每3～4 d觀察測量腫瘤大小并稱體質量[9]。試驗在甘肅中醫學院實驗動物中心進行。

2 結果與分析

2.1 復蘇及活力檢查

含血清培養的Hi5-S細胞凍存前活力為88.5%，平均復蘇活力為80.5%；無血清馴化的Hi5-SF細胞凍存前活力為87.8%，平均復蘇活力76.3%。與凍存前活力相比復蘇活力均有所下降，表明凍存過程對細胞有一定損傷，細胞復蘇后72～96 h可1∶4傳代擴增培養。

2.2 形態學觀察及生長特性

2.2.1 形態學觀察 High Five細胞(CCTCC株)未懸浮馴化前，細胞半貼壁生長，貼附的細胞多呈不規則多角形，為淋巴母細胞樣；經無血清懸浮馴化后的懸浮細胞株Hi5-SF細胞為圓球狀，大小均一，邊緣光滑、明亮(圖1)。

2.2.2 生長特性 Hi5-SF懸浮細胞以50×104mL-1活細胞密度接種時生長潛伏期較短，接種第2～3 d為明顯的指數生長期，第4 天進入穩定期，之后細胞活力下降，活細胞密度開始降低。生長曲線為較典型的“S”型(圖2)，最大增殖密度為3.50×106mL-1，群體倍增時間為26.2 h。

2.3 微生物污染檢查

Hi5-SF細胞經過培養和顯微觀察未發現細菌和真菌污染。支原體DNA染色法結果顯示，陽性對照細胞的細胞核呈藍色熒光，核外出現藍色熒光顆粒和絲狀點(圖3-a)；陰性對照只有細胞核呈藍色熒光，核外無藍色熒光顆粒(圖3-b)；待檢細胞的細胞核發出藍色熒光，核周圍無藍色熒光顆粒(圖3-c)，結果與陰性對照相同，說明待檢細胞沒有發生支原體污染。

2.4 病毒外源因子檢查

細胞培養觀察和血細胞吸附試驗結果顯示，細胞形態正常且無吸附血細胞現象。細胞裂解液接種到Vero、MRC-5和牛腎原代細胞上培養觀察和血凝試驗結果顯示，3種細胞均形態正常，血凝試驗和致細胞病變試驗結果均為陰性。

a.High Five細胞的φ=10% NBS培養，72 h High Five cell culture with NBS(φ=10%)，72 h；b.Hi5-SF細胞無血清培養，24 h Hi5-SF cell serum-free culture，24 h

圖1 High Five細胞和Hi5-SF細胞形態
Fig.1 Morphology of High Five cell and Hi5-SF cell

圖2 Hi5-SF細胞生長曲線Fig.2 Growth curve of Hi5-SF cell

特異性病毒熒光抗體結合物檢查試驗中，陽性對照結果(圖4-A)顯示，牛腎原代細胞上接種牛腺病毒3型(BAV-3)和牛腺病毒5型(BAV-5)，其細胞核呈現出較強的黃綠色熒光，細胞質也著色較淡且呈彌散裝(圖4-a，4-b)；接種牛腹瀉病毒(BVDV)后細胞質呈黃綠色熒光(圖4-c)；接種牛細小病毒(BPV)后細胞核呈強黃綠色熒光，細胞質幾乎不著色(圖4-f)；接種牛副流感病毒3型(PI-3)的細胞體呈黃綠色熒光，胞體中有著色較輕的球形斑(圖4-g)；接種呼腸孤病毒(REO)后細胞質呈強黃綠色熒光，胞質胞漿呈彌漫性淡黃綠色熒光(圖4-h)。在ST細胞上接種豬細小病毒(PPV)后細胞核呈明亮的黃綠色熒光(圖4-k)。陰性對照中(圖4-B)，牛腎原代細胞和ST細胞均未呈現熒光。試驗組(圖4-C)結果顯示，Hi5-SF細胞凍融裂解后的上清液接種到牛腎原代細胞和ST細胞中均未呈現熒光，與陰性對照一致，表明細胞未受外源病毒污染。

a.陽性對照 Positive control； b.陰性對照 Negative control；c.Hi5-SF細胞待檢樣 The sample of Hi5-SF cell

2.5 致瘤性檢查

致瘤性試驗結果顯示(圖5)，注射后第1周陽性對照組和陰性對照組均出現大小不一的腫瘤，第2周開始均減小并消失，待檢組裸鼠第2周腫瘤減小，但未消失。陽性對照組2周后開始成瘤且腫瘤逐漸增大，成瘤率100%(10/10)(圖5-A)；陰性對照組2周后腫瘤全部消失，成瘤率0%(0/10)(圖5-B)；待檢組2周后腫瘤增大，第40 天時全部消失，解剖未見轉移瘤形成，表明Hi5-SF懸浮細胞不致瘤。

A.陽性對照 Positive control； B.陰性對照 Negative control； C.試驗組 Sample group

a.BAV-3; b.BAV-5; c.BVDV; d.BAV-3; e.BAV-3; f.BPV g.PI-3; h.REO; i.BPV; j.BPV; k.:PPV; l.PPV; m.PPV

圖4 特異性病毒熒光抗體結合物檢查
Fig.4 Virus-specific fluorescent antibody conjugate test

A.陽性對照 Positive control； B.陰性對照 Negative control；C.試驗組 Sample group

3 討論與結論

細胞作為疫苗生產的基質，其質量直接影響疫苗的質量和安全性，1株細胞用于生產前必須進行全面的生物學鑒定和質量評價[10]。鑒別的方法包括觀察法(如顯微觀察)、生物化學法(如同工酶試驗)、免疫學檢測法(如組織相容性抗原)、細胞遺傳學檢測(如染色體核型)、分子生物學檢測法(如DNA指紋圖譜)等，評價內容包括細胞種屬鑒別、生長特征、微生物污染、內源和外源病毒因子檢查等，用于人用疫苗生產的細胞株還要進行活細胞的成瘤性、細胞碎片和細胞DNA的致癌性檢查，有時還需進行均一性及傳代穩定性檢查。

High Five細胞為半貼壁生長細胞，較容易馴化成懸浮細胞。馴化好的Hi5-SF細胞在26～28 ℃、120 r/min懸浮培養，細胞可穩定生長。剛適應無血清培養的細胞形態大小不均，細胞個體增大，并且容易結團，傳代穩定后細胞縮小且大小均一，表面圓滑，結團現象也消失。無血清懸浮培養的細胞由于缺少血清保護，以及搖晃過程中剪切力對細胞的損傷，細胞活力不是很穩定，一般情況細胞活力在85% 以上都是可接受的。增加凍存液中血清的含量能夠降低凍存過程對細胞的損傷。無血清培養的Hi5-SF細胞增殖速度快，50×104mL-1接種72 h平均可達到3.0×106mL-1左右。

本研究獲得的Hi5-SF懸浮細胞來源歷史清楚，生長狀態良好，生長曲線呈典型的“S”型，最大增殖密度為3.50×106mL-1，指數生長期倍增時間為26.2 h。細胞沒有被細菌、真菌和支原體等微生物污染。通過內源和外源病毒因子檢查排除致細胞病變和致紅細胞吸附病毒的污染可能。通過特異性熒光抗體結合物排除馴化前傳代培養過程中使用牛血清和胰蛋白酶可能造成的病毒污染，致瘤性檢查試驗排除細胞的致瘤性，表明用該細胞株進行獸用疫苗研究是安全的。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Establishment and Identification of Hi5-SF Suspension Cell Line

MA Wei1,WANG Jiamin1,MA Guilan2，MA Qi2,MA Hua1,QIAO Zilin1,MA Zhongren3and FENG Yuping3

(1.Gansu Engineering Research Center for Animal Cell,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China; 2.Lanzhou Bailing Bio-Tech CO.,LTD.,Lanzhou 730010,China;3.Key Laboratory of Bioengineering and Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China)

High Five cells were introduced from CCTCC and domestecated,,and we obtained semi-adherent cells to suspension growth cell line (Hi5-SF).Subsequently,the biological characteristics,microbial contamination,viral exogenous factors and tumorigenicity of Hi5-SF cell line were detected according to the Pharmacopoeia of People’s Republic of China (3rd Edition,2010).The results showed that the recovery vitality of Hi5-SF cells was 76.3%,the growth curve was S-shape,and maximum concentration was 3.50×106cells·mL-1with the population doubling time(PDT) of 26.2 h.The cells were free of bacteria,fungi and mycoplasmas;hemadsorption test,cytopathic test,specific virus fluorescent antibody binding test and tumorigenicity test were all negative.The resultus indicated that the Hi5-SF cell line meets the quality requirements of veterinary vaccine production.

High five cell; Suspension culture; Quality evaluation

MA Wei，male,master student.Research area:cell culture,the research and development of veterinary biological products.E-mail:670267497@qq.com

FENG Yuping,female,Ph.D,professor.Research area:development and utilization of biotechnology materials.E-mail:119236672@qq.com

日期：2016-12-29

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1005.006.html

2016-01-11

2016-03-27

教育部“長江學者和創新團隊發展計劃” (IRT13091)；甘肅省科技計劃(144FKCA082)；西北民族大學中央高校基本科研業務費專項資金(31920150029，zyp2015006)。

馬 偉，男，碩士研究生，從事細胞培養、獸用生物制品的開發研究。E-mail：670267497@qq.com

馮玉萍，女，博士，教授，主要從事生物技術材料的開發利用研究。E-mail：119236672 @qq.com

S85

A

1004-1389(2017)02-0173-06

Received 2016-01-11 Returned 2016-03-27

Foundation item The Pogram for Changjiang Scholars and Innovative Team of Ministry of Education(No.IRT13091); Science and Technology Project of Gansu Province (No.144FKCA082); the Project Fundamental Research Funds for the Central Universities of Northwest University For Nationalities (No.31920150029,No.zyp2015006).